Strese maruz kalmak protein toplanmasına neden olabilir ve bakterilerin fenotipik davranışında önemli değişikliklere neden olabilir. Bu videoda açıklanan prosedür, stres tedavisinden sonra protein agregalarının ekstraksiyonuna ve görselleştirilmesine izin verir. Yayınlanan diğer prosedürlerin aksine, bu protokol daha düşük hücre numaraları ve karmaşık fiziksel bozulma süreçlerinin yanı sıra zaman alıcı yıkama ve kuluçka adımlarından kaçınmayı gerektirir.
Bu protokol, çok çeşitli gram negatif ve gram pozitif bakterilerde protein toplamayı incelemek için kullanılabilir. Ayrıca gen silmelerin etkisini analiz edebilir veya proteotoksik bileşiklerin etkinliğini karşılaştırabilirsiniz. Her biri beş mililitre likojen et suyu veya LB, orta olan tek bir E.coli suşu MG1655 ve üropatojenik E.coli suşu CFT073 kolonisini aşılayarak başlayın.
İki et suyu kültürünü 37 santigrat derecede ve 300 rpm'de 14 ila 16 saat kuluçkaya yatırın. Her bir gerilimi 600 nanometre veya 0,1 OD600 optik yoğunluğa 70 mililitre MOPS-g ortamı içeren 500 mililitrelik bir şişeye seyreltin. Orta kütük aşamasına ulaşılana kadar şişeleri 37 derece ve 300 rpm'de kuluçkaya yatırın.
Kuluçkadan sonra, her kültürün 20 mililitresini önceden ısıtılmış üç 125 mililitrelik şişeye aktarın ve iki dakika boyunca 37 santigrat derece ve 300 rpm'de kuluçkaya bırakın. MOPS-g ortamında mililitre başına iki miligram antimikrobiyal bileşik çözelti hazırlayın. İstenilen konsantrasyonlara ulaşmak için bu çözümü her kültüre ekleyin ve tedavi edilmeyen kontrol için gerekli MOPS-g ortamını ekleyin.
45 dakikalık stres tedavisinden sonra her kültürün OD600'üni belirleyin. Her örnek için, 15 mililitre santrifüj tüplerine bir OD600 ile dört mililitre kültür aliquot. Hücre peletlerini 50 mikrolitre buz gibi lizis tamponunda yeniden depola.
Örnekleri buzda 30 dakika kuluçkaya yatır. Numunelere 360 mikrolitre buz gibi tampon A ekleyin ve pipetleme ile hafifçe karıştırın. Numuneleri yaklaşık 200 mikrolitre 0,5 milimetre cam boncuk içeren iki mililitrelik mikrosantrifüj tüplere aktarın.
Tüpleri 1400 rpm'de sallanarak bir ThermoMixer'da sekiz santigrat derecede 30 dakika kuluçkaya yatırın. Cam boncukları yerleştirmek için tüpleri sallamadan beş dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya yatırın. Daha sonra hücre lilatının 200 mikrolitresini 1,7 mililitrelik mikrosantrifüj tüplerine aktarın.
Hücreyi 20 dakika boyunca 16.000 kez g ve dört santigrat derecede santrifüjleyin. Daha sonra çözünür protein örneği olarak kullanılacak olan süpernatantı toplayın. 16.000 kez g ve dört santigrat derecede 200 mikrolitre buz-soğuk tampon A.Santrifüj 20 dakika boyunca pelet yeniden kullanmak için bir pipet kullanın.
Sonra dikkatlice üsttant tamamen kaldırmak. Peletin 200 mikrolitre buz gibi tampon B.Santrifüjünü tekrar yeniden kullanmak için bir pipet kullanın ve süpernatantı dikkatlice çıkarın. Daha sonra yıkamayı tampon A.Resuspend ile tekrarlayın, peleti 1x'in 100 mikrolitresinde SDS numune tamponu azaltın ve 95 santigrat derecede bir ThermoMixer'da beş dakika kaynatın.
%100 TCA'nın bir hacmini daha önce toplanan dört hacimli çözünür protein örneğiyle karıştırın ve protein çökeltme için dört santigrat derecede 10 dakika kuluçkaya yatırın. Çökeltme elde etmek için numuneyi 21.000 kez g ve dört santigrat derecede beş dakika santrifüjleyin ve üstnatantı çıkarın. Peleti yıkamak, hücresel kalıntıları gidermek için 200 mikrolitre buz gibi aseton kullanın.
Çökeltme elde etmek için numuneyi tekrar santrifüj edin ve üstnatantı çıkarın. Kalan asetonları peletlerden çıkarmak için ThermoMixer'daki mikrosantrifüj tüplerini kapakları açık olarak 37 santigrat derecede tutun. Daha sonra peletin tamamen çözünmesi için 100 mikrolitre 1x azaltıcı SDS tamponu ekleyin ve numuneyi beş dakika boyunca 95 santigrat derecede kaynatın.
Numuneyi ayırma için hemen bir SDS poliakrilamid jeline yükleyin veya daha sonra devam etmek için numuneyi eksi 20 santigrat derecede saklayın. Metin el yazmasında açıklandığı gibi iki ayırma jeli hazırlayın. Jeli bir mililitre pipet kullanarak cam plakaların arasına dökün, üst iki santimetrenin karışımdan arındırılmasını sağlayın.
Ayırma jelinin üzerine%70 etanol ekleyerek iki katman arasında eşit bir arayüz oluşturun. Ayırma jelleri polimerize olduktan sonra, metin el yazmasındaki talimatları kullanarak istifleme jellerini hazırlayın. Daha sonra etanolleri ayırma jellerinden çıkarın ve istifleme jeli çözeltisini ekleyin.
Hava kabarcıkları tanıtmadan istediğiniz sayıda cepli bir tarağı dikkatlice yerleştirin ve jelin 20 ila 30 dakika polimerize olmasını bekleyin. Her numunenin dört mikrolitresini ve protein merdivenini ayrı kuyulara yükleyin. Daha sonra jeli oda sıcaklığında 45 dakika boyunca 144 voltta tris glisinin çalışan tamponunda çalıştırın.
Jelleri bir rocker üzerinde 30 dakika lekelendirmek için önceden ısıtılmış Fairbanks çözümü A'yı ve istenen arka plan elde edilene kadar jelleri bir rocker üzerinde renksiz etmek için önceden ısıtılmış Fairbanks çözümü D'yi kullanın. Hücreler mililitre başına 175 mikrogram ve antimikrobiyal mililitre başına 200 mikrogram ile tedavi edildiğinde oluşan protein agrega miktarında, işlenmemiş hücrelere kıyasla bir artış gözlenmiştir. Çözünmeyen protein fraksiyonundaki artış daha hassas MG1655 suşunda daha belirgindi.
Hücreler tedavi edilmeyen hücrelere kıyasla mililitre başına 175 mikrogram ve antimikrobiyal mililitre başına 200 mikrogram ile tedavi edildiğinde çözünür protein miktarında bir azalma gözlenmiştir. Bu protokolü denerken, 600 nanometredeki optik yoğunluğa normalleşmenin, numunelerdeki protein toplama kapsamının karşılaştırılması için önemli olduğunu unutmayın.
