A exposição ao estresse pode causar agregação de proteínas e resultar em alterações significativas no comportamento fenotípico das bactérias. O procedimento descrito neste vídeo permite a extração e visualização de agregados proteicos após o tratamento do estresse. Em contraste com outros procedimentos publicados, este protocolo exige números de células mais baixos e se abstém de processos complicados de interrupção física, bem como etapas demoradas de lavagem e incubação.
Este protocolo pode ser usado para estudar a agregação de proteínas em uma grande variedade de bactérias gram-negativas e gram-positivas. Você também pode analisar o efeito das supressões genéticas ou comparar a eficácia dos compostos proteotóicos. Comece inoculando uma única colônia de e.coli cepa MG1655 e uropathogenic E.coli cepa CFT073, cada uma em cinco mililitros de caldo de lisogenia, ou LB, médio.
Incubar as duas culturas de caldo a 37 graus Celsius e 300 rpm por 14 a 16 horas. Diluir cada cepa a uma densidade óptica a 600 nanômetros, ou OD600, de 0,1 em um frasco de 500 mililitros contendo 70 mililitros de mops-g médio. Incubar os frascos a 37 graus e 300 rpm até que a fase de registro médio seja atingida.
Após a incubação, transfira 20 mililitros de cada cultura em três frascos pré-aquecidos de 125 mililitros, e incuba-os a 37 graus Celsius e 300 rpm por dois minutos. Prepare uma solução composta antimicrobiana de dois miligramas por mililitro no meio MOPS-g. Adicione esta solução a cada cultura para alcançar as concentrações desejadas e adicione o volume necessário de meio MOPS-g para o controle não tratado.
Determine o OD600 de cada cultura após 45 minutos de tratamento de estresse. Para cada amostra, alíquota quatro mililitros de cultura com um OD600 de um em tubos centrífugas de 15 mililitros. Resuspense as pelotas de célula em 50 microliters de tampão de lise gelada.
Incubar as amostras por 30 minutos no gelo. Adicione 360 microliters de tampão gelado A às amostras e misture suavemente por pipetação. Transfira as amostras para tubos de microcentrífuga de dois mililitros com cerca de 200 microlitres de contas de vidro de 0,5 milímetros.
Incubar os tubos por 30 minutos a oito graus Celsius em um ThermoMixer com agitação a 1400 rpm. Incubar os tubos no gelo por cinco minutos sem tremer para assar as contas de vidro. Em seguida, transfira 200 microlitres do lysato celular em tubos de microcentrífugo de 1,7 mililitro.
Centrifugar a célula lysate por 20 minutos a 16.000 vezes g e quatro graus Celsius. Recolhe o supernante, que será usado como amostra de proteína solúvel mais tarde. Use uma pipeta para resuspensar a pelota em 200 microliters de tampão gelado A.Centrifuge dos tubos a 16.000 vezes g e quatro graus Celsius por 20 minutos.
Em seguida, remova cuidadosamente o sobrenatante completamente. Use uma pipeta para resususpensar cuidadosamente a pelota em 200 microliters de tampão gelado B.Centrifuge os tubos novamente, e remova cuidadosamente o sobrenante. Em seguida, repita a lavagem com o buffer A.Resuspend a pelota em 100 microliters de 1x reduzindo o buffer de amostra SDS, e ferva-a por cinco minutos em um ThermoMixer a 95 graus Celsius.
Misture um volume de 100% TCA com quatro volumes da amostra de proteína solúvel coletada anteriormente, e incubar por 10 minutos a quatro graus Celsius para precipitação proteica. Centrifugar a amostra a 21.000 vezes g e quatro graus Celsius por cinco minutos para obter o precipitado, e remover o sobrenante. Use 200 microliters de acetona gelada para lavar a pelota, para remover detritos celulares.
Centrifugar a amostra novamente para obter o precipitado, e remover o supernatante. Para remover a acetona restante das pelotas, mantenha os tubos de microcentrifuuge no ThermoMixer a 37 graus Celsius com as tampas abertas. Em seguida, adicione 100 microliters de 1x reduzindo o buffer SDS para dissolver completamente a pelota, e ferva a amostra a 95 graus Celsius por cinco minutos.
Carregue imediatamente a amostra em um gel de poliacrilamida SDS para separação, ou armazene a amostra a menos 20 graus Celsius para prosseguir mais tarde. Prepare dois géis separados como descrito no manuscrito do texto. Despeje o gel entre as placas de vidro usando uma pipeta de um mililitro, garantindo que os dois centímetros superiores estejam livres da mistura.
Adicione 70% de etanol em cima do gel de separação, criando uma interface uniforme entre as duas camadas. Uma vez que os géis de separação tenham polimerizado, prepare os géis de empilhamento usando instruções no manuscrito do texto. Em seguida, retire o etanol dos géis de separação e adicione a solução de gel de empilhamento.
Insira cuidadosamente um pente com o número desejado de bolsos sem introduzir bolhas de ar, e deixe o gel polimerizar por 20 a 30 minutos. Carregue quatro microliters de cada amostra, bem como a escada de proteína, em poços separados. Em seguida, execute o gel em tampão de corrida tris-glicina a 144 volts por 45 minutos em temperatura ambiente.
Use a solução de Fairbanks pré-aquecida A para manchar os géis em um roqueiro por 30 minutos e a solução pré-aquecida de Fairbanks D para descolorir os géis em um roqueiro até que o fundo desejado seja alcançado. Observou-se aumento na quantidade de proteína agregada formada quando as células foram tratadas com 175 microgramas por mililitro e 200 microgramas por mililitro do antimicrobiano, em comparação com células não tratadas. O aumento da fração de proteína insolúvel foi mais acentuado na cepa MG1655 mais sensível.
Observou-se diminuição na quantidade de proteínas solúveis quando as células foram tratadas com 175 microgramas por mililitro e 200 microgramas por mililitro do antimicrobiano, em comparação com células não tratadas. Ao tentar este protocolo, tenha em mente que a normalização da densidade óptica a 600 nanômetros é importante para comparação da extensão da agregação de proteínas nas amostras.
