إن طريقة تصوير الإزاحة المربعة المتوسطة الصحيحة قادرة على استخراج كل من البنية والخصائص المتوسطة الديناميكية لكائن بيولوجي مستهدف في عينة حية في وقت واحد. تصوير إزاحة مربع المتوسط الصحيح ، هو إجراء سريع وقوي ، دون الحاجة إلى استخراج مسارات كائن واحد ولا حاجة لوضع العلامات المعقدة. إنه يتطلب فقط إعدادا بصريا قياسيا وموضوعا مثيرا للاهتمام يحمل علامة الفلورسنت.
تمهد هذه الطريقة الطريق للفحص الكمي واسع النطاق للتغيرات الهيكلية والديناميكية الموجودة على مستوى الهياكل النانوية تحت الخلوية في العديد من الحالات المرضية ، مثل السرطان أو السكري أو الاضطرابات التنكسية العصبية. سيوضح الإجراء فابيو أزاريلو ، طالب الدكتوراه من مختبري. للبدء في زراعة الخلايا الفرعية ، ابدأ بغسل طبق معالج بزراعة الأنسجة بطول 10 سنتيمترات من خلايا hela المتقاربة ، مرتين ، مع 0.01 PBS مولية.
ثم ، أضف 1 ملليلتر من 0.05٪ من التربسين-EDTA واحتضن الطبق عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة خمس دقائق. أعد تعليق الخلايا المنفصلة في 9 ملليلترات من وسط DMEM الكامل وجمع 10 ملليلتر من الوسط الكلي مع التربسين في أنبوب الطرد المركزي. زرع ما يقرب من 0.2 مليون خلية في كل طبق 35 ملم × 10 ملم مع الحجم المتوسط النهائي من 1 ملليلتر، ومن ثم احتضان الخلايا.
اعتمادا على البنية تحت الخلوية ذات الأهمية ، هناك حاجة إلى طريقة محددة لوضع العلامات ، وبمجرد أن يصبح حل وضع العلامات جاهزا ، اغسل الخلايا مرتين باستخدام 0.01 PBS مولار. بعد استبدال PBS بإعادة إنتاج الصبغة التي تحتوي على وسيط ، احتضن الطبق عند 37 درجة مئوية و 5٪ من ثاني أكسيد الكربون ، وفقا لتوصية الشركة المصنعة. في نهاية الحضانة ، اغسل الخلايا مرتين بوسط جديد قبل التجربة.
قبل إجراء عملية الاستحواذ على السلسلة ذات الفاصل الزمني ، قم بتشغيل نظام التحكم في حاضنة المجهر واترك المجهر يتوازن عند 37 درجة مئوية و 5٪ من ثاني أكسيد الكربون ، لمدة ساعتين تقريبا. استخدم ليزر الأرجون 488 نانومتر لإثارة EGFP في الخلايا المنقولة ، و Macropinesomes المسمى بالفلور ، وجمع انبعاث التألق بين 500 إلى 600 نانومتر ، باستخدام كاشف أنبوب مضاعف الصور القياسي. استخدم ليزر نيون الهيليوم 543 نانومتر لإثارة صبغة الفلورسنت ، وجمع الانبعاثات بين 555 إلى 655 نانومتر.
اضبط قطر ثقب الكشف على حجم Eri واحد. ولكل عملية استحواذ ، اجمع سلسلة من 1000 إطار متسلسل. اضبط وقت سكن البكسل على 2 ميكروثانية لكل بكسل لمدة إطار زمنية تبلغ 129 مللي ثانية.
لتهيئة المعلمات الأساسية لعمليات الاستحواذ بشكل صحيح، افتح iMSD. M مع محرر نصوص البرنامج. قم بتعيين المعلمات عن طريق كتابة قيم ل N'as عدد الإطارات في السلسلة الزمنية ، وحجم البكسل بالميكرومتر ، و f'as الدقة الزمنية في ثوان.
علاوة على ذلك ، قم بتعيين إدخال تصحيح خلفية المرشح إلى الصفر ، لمعالجة الصور الخام ، أو واحد ، لإجراء طرح خلفية يستند إلى العتبة. بعد ذلك ، قم بتعيين عتبة رسوم AV لتصحيح الخلفية. إذا تم تعيين قيمة المرشح كواحدة، تعيين وحدات البكسل ذات الكثافة الأقل من قيمة العتبة على أنها صفر.
بعد ذلك ، قم بتعيين بت كعدد صحيح يحدد أخذ عينات الكثافة. حفظ وتشغيل iMSD تحريرها. M ملف البرنامج النصي.
تحقق من تنفيذ البرنامج النصي في نافذة الأوامر، وفي حالة حدوث أي مشاكل، سيتم عرض رسالة التحذير التي تمت مقاطعتها. بعد تنفيذ البرنامج النصي بنجاح، قم باستيراد مكدس الصور واطرح الخلفية، إذا لزم الأمر. ثم احسب دالة الارتباط بين التباعد والزمان، باستخدام طريقة فورييه.
تناسب وظيفة الارتباط المكاني والزماني مع دالة غاوسية 2D. بعد ذلك ، تحقق من الإخراج الرسومي باستخدام منحنى IMSD ومنحنيات التركيب المقابلة ، المعروضة في ثلاث لوحات منفصلة لأنواع مختلفة من معادلة التركيب المستخدمة. يتم توفير قيم R-square في وسيلة إيضاح الرسم البياني.
ثم تحقق من إخراج النص. تم الحصول على صورة Lysosome كعضية اختبار ، في الخلايا الحية بدقة زمنية مناسبة ، ودقة زمنية منخفضة للغاية. كان التشوه الاصطناعي للليزوسوم بسبب حركة العضية مرئيا في الصورة منخفضة الدقة.
تم اشتقاق ملف تعريف كثافة البقعة باستخدام أداة خط في برنامج تحليل الصور. بعد ذلك ، تم إجراء تقدير قطر البقعة ، عن طريق تخطيط واستيفاء الكثافة بواسطة دالة غاوسية. وأسفر الاستحواذ بسرعة عالية عن متوسط حجم هيكل مماثل قريب من العينة الثابتة.
بدلا من ذلك ، زاد الاستحواذ بسرعة بطيئة من حجم الهيكل ، بسبب ديناميكيات البنية الطبيعية أثناء التصوير. وقد لوحظت الخصائص الهيكلية والدينامية للماكروبينيسومات أثناء الاتجار. وكشفت الملاحظات عن انخفاض في متوسط حجم الماكروبينوسومات.
تم الإشارة إلى الزيادة المصاحبة في الحركة دون المنتشرة ، من خلال انخفاض قيم ألفا. لكل عملية استحواذ ، لوحظت الزيادة في عدد Macropinesomes مع مرور الوقت. على النقيض من ذلك ، تشير القياسات المماثلة التي أجريت على ISGs ، إلى سلوك مختلف تماما لهذه العضيات الأخيرة مقارنة بالماكروبينسومات.
في الواقع ، تظهر حبيبات الأنسولين خصائص هيكلية أو ديناميكية غير متغيرة ، مما يشير إلى أنه تم فحصها في حالة ثابتة. يمكن تطبيق هذه الطريقة بسهولة في وضع اللون المزدوج ، إذا تم تصنيف عضيتين تحت خلوية متميزتين بشكل مختلف. في هذه الحالة ، سيسلط تحليل الارتباط المتبادل الضوء على التفاعلات الديناميكية المحتملة للكائنين داخل الخلية.
