Метод imaging the Right Average Square Displacement Method способен одновременно извлекать как структуру, так и динамические средние свойства целевого биологического объекта в живом образце. Визуализация правильного среднего квадратного смещения является быстрой и надежной процедурой, без необходимости извлечения траекторий отдельных объектов и без необходимости сложной маркировки. Это просто требует стандартной оптической установки и флуоресцентно маркированного объекта, представляющего интерес.
Метод прокладывает путь к крупномасштабному количественному скринингу структурных и динамических изменений, обнаруженных на уровне субклеточных наноструктур при нескольких патологических состояниях, таких как рак, диабет или нейродегенеративные расстройства. Продемонстрировать процедуру будет Фабио Аззарелло, аспирант из моей лаборатории. Чтобы начать субкультурацию клеток, начните с промывки 10-сантиметровой чашки, обработанной культурой, из сливающихся клеток хела, дважды, с 0,01 молярным PBS.
Затем добавьте 1 миллилитр 0,05% трипсина-ЭДТА и высиживают блюдо при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа в течение пяти минут. Повторно суспендировать отсоединенные клетки в 9 миллилитрах полной среды DMEM и собрать 10 миллилитров общей среды с трипсином в центрифужной трубке. Высевают примерно 0,2 миллиона клеток в каждую чашку размером 35 на 10 миллиметров с конечным объемом среды 1 миллилитр, а затем инкубируют клетки.
В зависимости от субклеточной структуры, представляющей интерес, требуется определенный метод маркировки, и как только раствор для маркировки будет готов, дважды промыть клетки 0,01 молярной PBS. После замены PBS на краситель, содержащий среду, инкубируйте блюдо при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа в соответствии с рекомендацией производителя. В конце инкубации дважды промыть клетки свежей средой перед экспериментом.
Прежде чем выполнять сбор серии, включите систему управления инкубатором микроскопа и дайте микроскопу уравновеситься при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа в течение примерно двух часов. Используйте 488-нанометровый аргоновый лазер для возбуждения EGFP в трансфектированных клетках и флуоресцентных меченых макропинесомах и собирайте флуоресцентное излучение от 500 до 600 нанометров, используя стандартный детектор трубки фотомножителя. Используйте 543-нанометровый гелиевый неоновый лазер для возбуждения флуоресцентного красителя и сбора излучения от 555 до 655 нанометров.
Установите диаметр точечного отверстия обнаружения на размер одного эри. И, для каждого приобретения, соберите серию из 1000 последовательных кадров. Установите время ожидания пикселя равным 2 микросекундам на пиксель в течение времени кадра 129 миллисекунд.
Чтобы правильно инициализировать инструментальные параметры для приобретений, откройте iMSD. M с программным текстовым редактором. Задайте параметры, введя значения для N'as — количество кадров во временном ряду, размер пикселя в микрометрах и f'as — временное разрешение в секундах.
Кроме того, установите входные данные коррекции фона фильтра равными нулю, чтобы обработать необработанные изображения, или единицу, чтобы выполнить вычитание фона на основе пороговых значений. Затем установите порог высоты AV для фоновой коррекции. Если значение фильтра задано равным единице, пиксели с интенсивностью ниже порогового значения будут установлены равными нулю.
Затем задайте бит в качестве целого числа, определяющего выборку интенсивности. Сохраните и запустите отредактированный iMSD. Файл скрипта M.
Проверьте выполнение скрипта в командном окне, и при возникновении каких-либо проблем отобразится предупреждение о прерывании. После успешного выполнения скрипта импортируйте стек изображений и при необходимости вычтите фон. Затем вычисляем пространственно-временную корреляционную функцию, используя метод Фурье.
Подогнать пространственно-временную корреляционную функцию к 2D-функции Гаусса. Затем проверьте графический вывод с кривой IMSD и соответствующими кривыми подгонки, отображаемыми в трех отдельных панелях для различных типов используемого уравнения подгонки. Значения R-квадрата указаны в легенде графа.
Затем проверьте вывод текста. Получение изображения лизосомы в качестве тестовой органеллы проводилось в живых клетках при соответствующем временном разрешении и очень низком временном разрешении. Артефактная деформация лизосомы, обусловленная движением органелл, была видна на изображении с низким разрешением.
Профиль интенсивности пятна был получен с использованием линейного инструмента в программном обеспечении для анализа изображений. Затем была выполнена оценка диаметра пятна путем построения и интерполяции интенсивности функцией Гаусса. Приобретение на высокой скорости дало сопоставимый средний размер структуры, близкий к фиксированной выборке.
Вместо этого, захват с медленной скоростью, увеличил размер структуры, благодаря естественной динамике структуры во время визуализации. Структурные и динамические свойства макропинесом наблюдались во время незаконного оборота. Наблюдения выявили уменьшение среднего размера макропиносом.
Сопутствующее увеличение субдиффузного движения обозначается уменьшением значений альфа. Для каждого приобретения наблюдалось увеличение числа макропинесом со временем. Напротив, аналогичные измерения, проведенные на ISG, предполагали совершенно иное поведение этих последних органелл по сравнению с макропинесомами.
Фактически, гранулы инсулина показывают неизмененные, средние структурные или динамические свойства, предполагая, что они были исследованы в стационарном состоянии. Метод может быть легко применен в двухцветном режиме, если две различные субклеточные органеллы помечены по-разному. В этом случае перекрестно-корреляционный анализ выявит потенциальные динамические взаимодействия двух объектов внутри ячейки.
