O Método de Deslocamento Médio Direito é capaz de extrair simultaneamente tanto a estrutura quanto as propriedades médias dinâmicas de um objeto biológico alvo em uma amostra viva. A imagem do Deslocamento Médio Direito do Quadrado é um procedimento rápido e robusto, sem necessidade de extrair trajetórias de objeto único e sem necessidade de rotulagem complexa. Ele só requer uma configuração óptica padrão e um objeto de interesse fluorescentemente rotulado.
O método abre caminho para o rastreamento quantitativo em larga escala das alterações estruturais e dinâmicas encontradas no nível de nano-estruturas subcelulares em várias condições patológicas, como câncer, diabetes ou distúrbios neurodegenerativos. Demonstrando o procedimento estará Fabio Azzarello, doutorando do meu laboratório. Para começar a subculturar as células, comece lavando um prato tratado de cultura de tecido de 10 centímetros de células helas confluentes, duas vezes, com PBS molar de 0,01.
Em seguida, adicione 1 mililitro de 0,05% trypsin-EDTA e incubar o prato a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por cinco minutos. Suspenda as células destacadas em 9 mililitros de meio DMEM completo e colete 10 mililitros de meio total com trippsina no tubo de centrífuga. Semente aproximadamente 0,2 milhões de células em cada prato de 35 milímetros por 10 milímetros com o volume médio final de 1 mililitro, e, em seguida, incubar as células.
Dependendo da estrutura subcelular de interesse, é necessário um método específico de rotulagem e, uma vez que a solução de rotulagem esteja pronta, lave as células duas vezes com PBS molar 0,01. Após substituir a PBS pelo re-agente de corante contendo meio, incubar o prato a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono, conforme recomendação do fabricante. No final da incubação, lave as células duas vezes com um meio fresco antes do experimento.
Antes de realizar a aquisição da série time-lapsed, ligue o sistema de controle da incubadora de microscópio e deixe o microscópio equilibrar a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono, por cerca de duas horas. Use um laser de argônio de 488 nanômetros para excitação de EGFP em células transfeinadas, e macropinesomes rotulados por fluorescene, e colete a emissão de fluorescência entre 500 e 600 nanômetros, usando um detector de tubos multiplicador de fotos padrão. Use um laser de hélio de 543 nanômetros para excitar o corante fluorescente e coletar a emissão entre 555 a 655 nanômetros.
Coloque o diâmetro do pinhole de detecção ao tamanho de um Eri. E, para cada aquisição, colete uma série de 1000 quadros sequenciais. Defina o tempo de permanência do pixel para 2 microsegundos por pixel para um tempo de 129 milissegundos.
Para inicializar adequadamente os parâmetros instrumentais para as aquisições, abra o iMSD. M com o editor de texto do software. Defina os parâmetros digitando valores para N'as como o número de quadros na série temporal, o tamanho do pixel em micrômetros e f'as como a resolução temporal em segundos.
Além disso, defina a entrada de correção de fundo do filtro para zero, para processar imagens brutas ou uma, para realizar uma subtração de fundo baseada em limiar. Em seguida, defina o limite de pedágio AV para correção de fundo. Se o valor do filtro for definido como um, pixels com uma intensidade inferior ao valor de limiar serão definidos como zero.
Em seguida, coloque bit como o número inteiro determinando a amostragem de intensidade. Salve e execute o iMSD editado. Arquivo de script M.
Verifique a execução do script na janela de comando e, se ocorrer algum problema, a mensagem de aviso interrompida será exibida. Após a execução bem sucedida do script, importe a pilha de imagens e subtraia o plano de fundo, se necessário. Em seguida, calcule a função de correlação spacio-temporal, utilizando o método Fourier.
Encaixe a função de correlação espátula-temporal com uma função gaussiana 2D. Em seguida, verifique a saída gráfica com a curva IMSD e as curvas de encaixe correspondentes, exibidas em três painéis separados para diferentes tipos da equação de montagem utilizada. Os valores R-quadrado são fornecidos na legenda do gráfico.
Em seguida, verifique a saída de texto. A aquisição de imagem de Lysosome como organela de teste, foi realizada em células vivas na resolução temporal adequada, e resolução temporal muito baixa. A deformação artefatofato do Lysosome devido ao movimento organela, era visível na imagem de baixa resolução.
O perfil de intensidade do local foi derivado utilizando uma ferramenta de linha no software de análise de imagens. Em seguida, foi realizada a estimativa do diâmetro do ponto, plotando e interpolando a intensidade por uma função gaussiana. A aquisição em alta velocidade, rendeu um tamanho médio de estrutura comparável próximo à amostra fixa.
Em vez disso, a aquisição em uma velocidade lenta, aumentou o tamanho da estrutura, devido à dinâmica da estrutura natural durante a imagem. As propriedades estruturais e dinâmicas dos Macropinesomes foram observadas durante o tráfico. As observações revelaram uma diminuição no tamanho médio dos Macropinossomos.
O aumento concomitante no movimento sub-difuso, foi denotado pela diminuição dos valores alfa. Para cada aquisição, observou-se o aumento do número de Macropinesomes com o tempo. Em contraste, medições semelhantes realizadas em ISGs, sugeriram um comportamento muito diferente dessas últimas organelas em comparação com macropinesomes.
Na verdade, os grânulos de insulina mostram propriedades estruturais ou dinâmicas inalteradas, médias, sugerindo que foram sondadas em um estado estacionário. O método pode ser facilmente aplicado no modo de cores duplas, se duas organelas subcelulares distintas forem rotuladas de forma diferente. Neste caso, a análise de correlação cruzada destacará as possíveis interações dinâmicas dos dois objetos dentro da célula.
