La méthode Imaging the Right Mean Square Displacement Method est capable d’extraire simultanément la structure et les propriétés moyennes dynamiques d’un objet biologique cible dans un échantillon vivant. L’imagerie du déplacement carré moyen droit est une procédure rapide et robuste, sans besoin d’extraire des trajectoires d’objet unique et sans besoin d’étiquetage complexe. Il nécessite simplement une configuration optique standard et un objet d’intérêt étiqueté par fluorescence.
La méthode ouvre la voie au dépistage quantitatif à grande échelle des altérations structurelles et dynamiques trouvées au niveau des nanostructures subcellulaires dans plusieurs conditions pathologiques, telles que le cancer, le diabète ou les troubles neurodégénératifs. Fabio Azzarello, un doctorant de mon laboratoire, fera la démonstration de la procédure. Pour commencer à sous-cultiver les cellules, commencez par laver un plat de 10 centimètres traité par culture tissulaire de cellules hela confluentes, deux fois, avec 0,01 PBS molaire.
Ensuite, ajoutez 1 millilitre de 0,05% de trypsine-EDTA et incubez le plat à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pendant cinq minutes. Remettez en suspension les cellules détachées dans 9 millilitres de milieu DMEM complet et collectez 10 millilitres de milieu total avec de la trypsine dans le tube de centrifugeuse. Ensemencez environ 0,2 million de cellules dans chaque plat de 35 millimètres sur 10 millimètres avec le volume moyen final de 1 millilitre, puis incubez les cellules.
Selon la structure subcellulaire d’intérêt, une méthode de marquage spécifique est nécessaire et, une fois la solution de marquage prête, laver les cellules deux fois avec 0,01 PBS molaire. Après avoir remplacé le PBS par le milieu contenant un réimposé colorant, incuber le plat à 37 degrés Celsius et à 5% de dioxyde de carbone, conformément à la recommandation du fabricant. À la fin de l’incubation, lavez les cellules deux fois avec un milieu frais avant l’expérience.
Avant d’effectuer l’acquisition en série accélérée, allumez le système de contrôle de l’incubateur du microscope et laissez le microscope s’équilibrer à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone, pendant environ deux heures. Utilisez un laser à argon de 488 nanomètres pour l’excitation de l’EGFP dans les cellules transfectées et des macropinésomes marqués à la fluorescence, et collectez l’émission de fluorescence entre 500 et 600 nanomètres, à l’aide d’un détecteur à tube photomultiplicateur standard. Utilisez un laser au néon d’hélium de 543 nanomètres pour exciter le colorant fluorescent et collectez l’émission entre 555 et 655 nanomètres.
Réglez le diamètre du sténopé de détection sur la taille d’un Eri. Et, pour chaque acquisition, collectez une série de 1000 images séquentielles. Réglez le temps de séjour des pixels à 2 microsecondes par pixel pour une durée d’image de 129 millisecondes.
Pour initialiser correctement les paramètres instrumentaux des acquisitions, ouvrez iMSD. M avec l’éditeur de texte logiciel. Définissez les paramètres en tapant des valeurs pour N’as le nombre d’images dans la série chronologique, la taille des pixels en micromètres et f’as la résolution temporelle en secondes.
En outre, définissez l’entrée de correction d’arrière-plan du filtre sur zéro, pour traiter les images brutes, ou une, pour effectuer une soustraction d’arrière-plan basée sur un seuil. Ensuite, définissez le seuil de péage AV pour la correction en arrière-plan. Si la valeur du filtre est définie sur un, les pixels dont l’intensité est inférieure à la valeur de seuil sont définis sur zéro.
Ensuite, définissez bit comme nombre entier déterminant l’échantillonnage d’intensité. Enregistrez et exécutez l’iMSD modifié. Fichier de script M.
Vérifiez l’exécution du script dans la fenêtre de commande et, en cas de problème, le message d’avertissement interrompu s’affiche. Après l’exécution réussie du script, importez la pile d’images et soustrayez l’arrière-plan, si nécessaire. Ensuite, calculez la fonction de corrélation spacio-temporelle, en utilisant la méthode de Fourier.
Ajuster la fonction de corrélation spatio-temporelle avec une fonction gaussienne 2D. Ensuite, vérifiez la sortie graphique avec la courbe IMSD et les courbes de raccord correspondantes, affichées dans trois panneaux distincts pour différents types d’équation de raccord utilisées. Les valeurs R-carré sont fournies dans la légende du graphique.
Ensuite, vérifiez la sortie du texte. L’acquisition d’images du lysosome en tant qu’organite de test a été réalisée dans des cellules vivantes à la résolution temporelle appropriée et à une très faible résolution temporelle. La déformation artificielle du lysosome due au mouvement de l’organite était visible dans l’image basse résolution.
Le profil d’intensité du spot a été calculé à l’aide d’un outil linéaire dans le logiciel d’analyse d’images. Ensuite, l’estimation du diamètre du spot a été réalisée, en traçant et en interpolant l’intensité par une fonction gaussienne. L’acquisition à grande vitesse a donné une taille de structure moyenne comparable proche de l’échantillon fixe.
Au lieu de cela, l’acquisition à une vitesse lente, a augmenté la taille de la structure, en raison de la dynamique naturelle de la structure pendant l’imagerie. Les propriétés structurelles et dynamiques des macropinésomes ont été observées pendant le trafic. Les observations ont révélé une diminution de la taille moyenne des macropinosomes.
L’augmentation concomitante du mouvement sous-diffusif a été notée par une diminution des valeurs alpha. Pour chaque acquisition, l’augmentation du nombre de macropinésomes avec le temps a été observée. En revanche, des mesures similaires effectuées sur les ISG, ont suggéré un comportement très différent de ces derniers organites par rapport aux macropinésomes.
En fait, les granules d’insuline présentent des propriétés structurelles ou dynamiques moyennes inchangées, ce qui suggère qu’ils ont été sondés dans un état stationnaire. La méthode peut être facilement appliquée en mode bicolore, si deux organites subcellulaires distincts sont étiquetés différemment. Dans ce cas, l’analyse de corrélation croisée mettra en évidence les interactions dynamiques potentielles des deux objets au sein de la cellule.
