Imaging the Right Mean Square Displacement Method'는 살아있는 샘플에서 표적 생물학적 물체의 구조와 동적 평균 특성을 동시에 추출 할 수 있습니다. 오른쪽 평균 제곱 변위를 이미징하는 것은 빠르고 견고한 절차로, 단일 물체 궤적을 추출할 필요가 없으며 복잡한 라벨링이 필요하지 않습니다. 표준 광학 설정과 형광 라벨이 붙은 관심 대상만 있으면 됩니다.
이 방법은 암, 당뇨병 또는 신경 퇴행성 장애와 같은 여러 병리학 적 조건에서 세포 내 구조의 수준에서 발견되는 구조적 및 동적 변화의 대규모, 정량적 스크리닝에 대한 길을 열어줍니다. 절차를 시연하는 것은 내 실험실의 박사 과정 학생 인 Fabio Azzarello가 될 것입니다. 세포를 계대 배양하기 시작하려면, 먼저 컨플루언트 헬라 세포의 10 센티미터 조직 배양 처리 접시를 0.01 몰 PBS로 두 번 세척하였다.
그런 다음 0.05 % 트립신-EDTA 1 밀리리터를 넣고 섭씨 37도에서 접시를 5 분 동안 5 % 이산화탄소로 인큐베이션하십시오. 분리된 세포를 9밀리리터의 완전한 DMEM 배지에 재현탁시키고 원심분리 튜브에 트립신으로 총 배지 10밀리리터를 수집한다. 1 밀리리터의 최종 배지 부피로 각 35 밀리미터 x 10 밀리미터 접시에 대략 0.2 백만 개의 세포를 시드한 다음, 세포를 인큐베이션한다.
관심있는 아세포 구조에 따라, 특정 표지 방법이 요구되며, 일단 표지 용액이 준비되면, 세포를 0.01 몰 PBS로 두 번 세척한다. PBS를 염료 시약 함유 배지로 교체 한 후 제조업체의 권장 사항에 따라 섭씨 37도 및 5 % 이산화탄소에서 접시를 배양하십시오. 배양이 끝나면 실험 전에 신선한 배지로 세포를 두 번 세척하십시오.
시간 경과 된 시리즈 수집을 수행하기 전에 현미경 인큐베이터 제어 시스템을 켜고 현미경이 섭씨 37도 및 이산화탄소 5 %에서 약 두 시간 동안 평형을 이루도록하십시오. 형질감염된 세포에서 EGFP의 여기를 위해 488 나노미터 아르곤 레이저를 사용하고, 플루오레씬-표지된 마크로피네좀을, 표준 사진 승수 튜브 검출기를 사용하여 500 내지 600 나노미터 사이의 형광 방출을 수집한다. 543 나노미터 헬륨 네온 레이저를 사용하여 형광 염료를 여기시키고, 555 내지 655 나노미터 사이의 방출을 수집한다.
감지 핀홀의 지름을 하나의 Eri 크기로 설정합니다. 그리고 각 획득에 대해 일련의 1000 개의 순차 프레임을 수집하십시오. 프레임 시간 동안 픽셀 유지 시간을 픽셀당 2마이크로초로 설정합니다.
획득을 위한 도구 매개 변수를 올바르게 초기화하려면 iMSD를 엽니다. M과 소프트웨어 텍스트 편집기. N'as 에 대한 값을 시계열의 프레임 수로, 픽셀 크기를 마이크로미터 단위로, f'를 시간 해상도(초)로 입력하여 매개변수를 설정합니다.
또한, 필터 배경 보정 입력을 0으로 설정하거나, 원시 이미지를 처리하거나, 또는 하나를 설정하여, 임계값 기반 배경 뺄셈을 수행한다. 다음으로, 배경 보정을 위해 AV 통행료 임계값을 설정합니다. 필터 값이 하나로 설정되면 임계값보다 낮은 강도의 픽셀이 0으로 설정됩니다.
다음으로, 비트를 강도 샘플링을 결정하는 정수 숫자로 설정합니다. 편집한 iMSD를 저장하고 실행합니다. M 스크립트 파일.
명령 창에서 스크립트 실행을 확인하고 문제가 발생하면 중단된 경고 메시지가 표시됩니다. 스크립트 실행이 성공적으로 완료되면 이미지 스택을 가져오고 필요한 경우 배경을 뺍니다. 그런 다음 푸리에 방법을 사용하여 스파시오-시간 상관 함수를 계산합니다.
시공간-시간적 상관 함수를 2D 가우시안 함수와 맞춥니다. 그런 다음 IMSD 곡선과 해당 피팅 곡선을 사용하여 그래픽 출력을 확인하고 사용된 피팅 방정식의 여러 유형에 대해 세 개의 개별 패널에 표시합니다. R-제곱 값은 그래프 범례에 제공됩니다.
그런 다음 텍스트 출력을 확인하십시오. 시험 소기관으로서 리소좀의 이미지 획득은, 적절한 시간적 해상도 및 매우 낮은 시간적 해상도로 살아있는 세포에서 수행되었다. 소기관 운동으로 인한 리소좀의 인공적인 변형은 저해상도 이미지에서 볼 수 있었다.
스팟의 강도 프로파일은 이미지 분석 소프트웨어에서 라인 툴을 사용하여 도출되었다. 이어서, 스폿 직경 추정을 수행하여, 가우시안 함수에 의해 강도를 플로팅하고 보간하였다. 고속에서의 획득은, 고정된 샘플에 근접한 대등한 평균 구조 크기를 산출하였다.
대신, 느린 속도로 획득하여, 이미징 동안 자연적인 구조 역학으로 인해 구조 크기를 증가시켰다. Macropinesomes의 구조적 및 동적 특성은 인신 매매 중에 관찰되었습니다. 관찰 결과 Macropinosomes의 평균 크기가 감소한 것으로 나타났습니다.
하위 확산 운동의 수반되는 증가는 감소된 알파'값으로 표시되었다. 각각의 획득에 대해, 시간에 따른 마크로피네좀의 수의 증가가 관찰되었다. 대조적으로, ISGs에 대해 수행 된 유사한 측정은 Macropinesomes와 비교하여 이러한 후자의 소기관의 매우 다른 행동을 시사했습니다.
사실, 인슐린 과립은 변하지 않은, 평균 구조적, 또는 역동적 인 특성을 보여 주며, 이는 고정 된 상태에서 조사되었음을 암시합니다. 이 방법은 두 개의 별개의 아세포 소기관이 다르게 라벨링되는 경우 이중 색상 모드에서 쉽게 적용 할 수 있습니다. 이 경우 상호 상관 관계 분석은 세포 내의 두 개체의 잠재적 인 동적 상호 작용을 강조합니다.
