فإن الكتاب أود أن أشكر تيفاني الكرز في مساعدتها في تحسين هذا البروتوكول. وقد تم تمويل هذا العمل عن طريق المعهد الوطني للشيخوخة (AG032320) ، وكذلك النهوض أكثر صحة ولاية ويسكونسن.

الرجوع إلى الشكل 1 لالتخطيطي الأساسي لبداية الإجراء مع جناسة. الوقت المقدر من إعداد مقتطفات من الخليوي الى شطف CAM متجهة البروتينات حوالي 6-7 ساعات. 1. إعداد الأنسجة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حقن شرائح الحصين عضوي النمط مع فيروس يحتوي على البلازميد التعبير عن بروتين المؤتلف من الاهتمام (في هذا المثال ، الأخضر ببروتين (GFP) الموسومة نغ) والسماح للتعبير عن بروتين الأنسجة بين عشية وضحاها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ما يقرب من 12 إلى 18 ساعة بعد الحقن الفيروسي (اعتمادا على الوقت التعبير الفيروسية) ، وإعداد لجمع الأنسجة. إضافة 1mL العازلة تشريح (الجلوكوز 10MM ، 4mM بوكل ، NaHCO3 26mM ، والسكروز 233mM ، MgCl 5mM 2 ، 1MM CaCl 2 ، و 0.1 ٪ الفينول الحمراء ، بالغاز مع 5 ٪ CO 2 95 ٪ O 2) في طبق بتري. نقل الأنسجة المستنبتة / تضاف إلى صحن بتري وإضافة 2mL العازلة تشريح لادخال لغمر الأنسجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جامعير نسيج عضوي النمط الحصين (بين 5 و شرائح 10) عن طريق كشط بلطف الأنسجة خالية من الغشاء إدراج باستخدام مشرط. على وجه التحديد إزالة منطقة معينة من الفائدة (على سبيل المثال CA1) هو أيضا خيار. نقل الأنسجة علقت لأنبوب microcentrifuge 1.5mL باستخدام ماصة باستير مقلوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي عينات في إطار التعاون الإقليمي ل1500 1 دقيقة لفصل الأنسجة العازلة من تشريح. إزالة بعناية طاف بواسطة الطموح. تأكد من عدم تعكير صفو بيليه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لكل شريحة المستخدمة ، إضافة 30-60 ميكرولتر من التجانس العازلة (150mM كلوريد الصوديوم ، 20mM تريس درجة الحموضة 7.5 ، DTT 1MM ، leupeptin 1μg/mL ، chemostatin 1μg/mL ، antipain 1μg/mL ، pepstatin 1μg/mL ، و 1 ٪ X تريتون -100) إلى الأنسجة والتجانس تماما مع مدقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> من أجل إزالة الأنقاض الخلوية ، وأجهزة الطرد المركزي لجناسة المتبقية في إطار التعاون الإقليمي 1100 لمدة 10 دقيقة وإزالتها بعناية طاف بواسطة الطموح وفي الوقت نفسه تجنب التلوث من بيليه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأخذ 10 ٪ من طاف على عينة من المدخلات (نموذج 1). تخزين طاف المتبقية على الجليد خلال إعداد حبات CAM - sepharose للاستخدام في الخطوة 3. </li></ol> ملاحظة : والأنسجة المستخدمة هنا هي شرائح الحصين عضوي النمط. ومع ذلك ، يمكن للمرء أن استخدام الخلايا العصبية أو فصل أي استنبات الخلايا النظام الأخرى. في مثل هذه الحالة ، يبدأ في الخطوة بعد جمع 1.4 النسيج الخاص بالطريقة المناسبة. 2. إعداد حبات لسحب أسفل في التعامل مع الخرز ، وأنه من المهم لإنقاذ الخرز وتحقيق أقصى قدر من الكفاءة لردود الفعل من خلال منع تجفيف حبات من على جانبي الأنبوب. للقيام بذلك ، فمن الأفضل لتدوير أنابيب الخاص إلى جانبهم ، مما يتيح حل لحبات الرطب على جدران الأنبوب ، مباشرة قبل الطرد المركزي. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لكل المنسدلة ، ماصة 400 ميكرولتر من الخرز كالمودولين - Sepharose علقت في أنبوب microcentrifuge 2 مل مع FLA نسبياتي أسفل إلى أقصى مساحة والتفاعل من الحلول الخاصة بك مع الخرز خلال حضانات الخاصة بك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الخرز الطرد المركزي في إطار التعاون الإقليمي 21000 لمدة 30 ثانية وإزالة بعناية طاف بواسطة الطموح. تأكد من عدم تعكير صفو الخرز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لغسل الخرز ، وإضافة 100 ميكرولتر من المنطقة العازلة التي تحتوي كل منها التجانس إما CaCl 2 مم 2 إلى تلك المستخدمة لالمنسدلة كا 2 + كام البروتينات ملزمة وEDTA 2 مم (أ + خالب المعروفة كا 2) ليهبطوا الخرز البروتينات ApoCaM ملزمة. اضغط بلطف أنبوب لاعادة تعليق الخرز والطرد المركزي في إطار التعاون الإقليمي ل1500 1 دقيقة. إزالة بعناية طاف بواسطة الشفط ، والتأكد من عدم تعكير صفو الخرز. </li></ol> ملاحظة : للحصول على جميع الخطوات طموح ، فمن المستحسن استخدام ماصة الحافة التي لديها افتتاح غرامة (مثل هلام نصائح التحميل) للسماح إزالة حل دون إزالة الخرز. 3. CAM - sepharose ملزم للبروتينات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انقسام طاف بك إلى شرطين تحتوي على حجم مساو. اعتمادا على حالتك ، وإضافة كمية مناسبة من CaCl 2 أو EDTA لطاف بك إلى تركيز 2 مم لكل منها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة طاف خطوة من 1.7 إلى حبات غسلها في تجانس العازلة المقابلة. اضغط برفق لمزج أنبوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان العينات في درجة مئوية لمدة 3 ساعات 4 على شاكر. اعادة تعليق الخرز كل 30 دقيقة او نحو ذلك لزيادة كفاءة ملزمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أنبوب الطرد المركزي التي تحتوي على عينات والخرز في RCF 1500 لمدة 3 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأخذ 50μL من طاف على عينة من البروتين غير منضم (نموذج 2) وإزالة بعناية طاف المتبقية الطموح وتجاهل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغسل حبات ثلاث مرات كما هو موضح في الخطوة 2.3 باستخدام 100μL العازلة من التجانس منها. </li></ol> 4. شطف <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 50μL العازلة من شطف (50mM تريس ، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 7.5 ، وكلوريد الصوديوم 150mM) يحتوي على شرط المعاكس (C 10MMدوري أبطال آسيا 2 أو EDTA 10MM) إلى الخرز. على سبيل المثال ، والعينات التي تم الالتزام به في المتجانس والتي تحتوي على الكالسيوم العازلة 2 + هي eluted في شطف العازلة التي تحتوي على EDTA والعكس بالعكس. </li></ol> اختياري : الاحترار شطف المنطقة العازلة إلى 37 درجة مئوية قبل إضافة إلى الخرز قد تعزيز الغلة. <ol start="2" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان حل مع الخرز في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة على شاكر. مزج الخرز بالنقر برفق الانبوب عن كل 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الخرز الطرد المركزي في 1500 لمدة 3 دقائق التعاون الإقليمي وإزالة بعناية 50μL من طاف للبروتين منضم (نموذج 3) بواسطة الطموح. تأكد من عدم تعكير صفو الخرز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة البروتين المخزن التحميل لجميع العينات (أي جناسة ، غير منضم وملزمة البروتين وكذلك تلك التي لا تزال ملزمة للالخرز). </li></ol> ملاحظة : للتعظيم شطف (وخصوصا في حالة عدم كفاءة شطف) ، إضافة 50μL من شطف العازلة المقابلة (على سبيل المثال تحتوي مضيفا EDTA BUFفر إلى حبات منضم في CaCl 2) على حبات قبل التدفئة عينات لمساعدة أزل أي بروتين ملزمة المتبقية وكرر الخطوات الموضحة في 4.3 لإزالة بروتينات ملزمة المتبقية. 5. SDS - PAGE وصمة عار الغربية سلوك SDS - PAGE وتحليل باستخدام لطخة الغربية التي تحقق للبروتين اهتمامكم والتحقيق لبروتين معروف لربط كاميرا في حالة العكس كعنصر تحكم إيجابية. 6. ممثل النتائج ويبين الشكل 2B مثال مقايسة CAM - المنسدلة اختبار ملزمة كاميرا GFP الموسومة نغ مقابل نغ الذاتية. للقيام بذلك ، وكان overexpressed GFP - NG في شرائح دينا الحصين عضوي النمط بين عشية وضحاها ، وكان النسيج المتجانس. والمحتضنة لجناسة مع CAM - sepharose حبات في وجود إما كا 2 + أو EDTA. مدخلات جناسة يبين أن أعرب عن GFP - NG بالإضافة إلى نج الذاتية والكالسيوم 2 + / CAM التي تعتمد على كيناز الثاني(كناس CaMKII). كما هو متوقع على أساس الربط المعروفة نغ الذاتية (موضح في الشكل 2A) ، GFP الموسومة كان eluted نغ في غياب الكالسيوم 2 + (EDTA بالبروتين) وغير منضم في وجود الكالسيوم 2 + (الشكل 2B) . في المقابل ، كان eluted السيطرة ، كناس CaMKII ، إلا في وجود الكالسيوم 2 + (بروتين ملزمة) وكان غير منضم في غيابها (EDTA). هذا يدل على أن حبات كاميرا كانت تعمل بشكل صحيح وelutions وكفاءة. الأهم من ذلك ، هذا يدل على أن GFP - NG بربط ApoCaM بطريقة مماثلة للنموذج الذاتية ، مما يوحي بأن العلامة GFP لم يغير من وظيفة لدينا البروتين المؤتلف. <img src="/files/ftp_upload/3502/3502fig1.jpg" alt="الشكل 1"/> الشكل 1. الخطوط العريضة للكاميرا المنسدلة مقايسة (A) هو نسج جناسة الأنسجة وصولا الى ازالة الحطام الخلوية. يؤخذ حوالي 10 ٪ من طاف على عينة من المدخلات (1). ينقسم طاف المتبقية بالتساوي على مختلفتضاف الشروط والكواشف المناسب (CaCl 2 أو EDTA) لاختبار ملزمة في هذه الظروف. يتم تحميل كل طاف (التي تحتوي على إما CaCl 2 أو EDTA) على حبات CAM - sepharose أعدت على التوالي و (ب) المحتضنة للسماح ملزمة. تتم إزالة البروتينات غير منضم (2) و (C) هي eluted البروتينات ملزمة (3) الخروج من الخرز باستخدام العازلة شطف (EB) يحتوي على العكس كما شرط الربط. ويمكن تحليلها لتكوين البروتين من هذه العينات الثلاث باستخدام بروتين SDS - PAGE والغربية لطخة تحليل. <img src="/files/ftp_upload/3502/3502fig2.jpg" alt="الشكل 2"/> وتعطى الرقم 2. A.) تخطيطي للكا 2 + CAM ملزمة تعتمد على أمثلة وشطف في مقايسة المنسدلة من نوعين من البروتينات التي تربط كاميرا في كا 2 + التي تعتمد على الطريقة. Neurogranin (نغ) تمثل البروتينات التي تربط الاشتقاق كام وكناس CaMKII تمثل البروتينات التي تربط لكا 2 + الغنيةكاميرا. ويظهر في كاميرا حالته فصلها قبل الحضانة مع البروتينات جناسة. حضنت مرة واحدة في ظل ظروف من تركيزات عالية من الكالسيوم + 2 (2 ملم) أو في وجود الكالسيوم 2 + خالب ، EDTA (2 ملم) ، والبروتينات وربط كاميرا تبعا لذلك. نانوغرام بربط كاميرا في حالة EDTA كما أن هناك شيئا يذكر لولا كا 2 + الحاضر ، وسيكون eluted قبالة الخرز CAM - sepharose في وجود الكالسيوم 2 +. كناس CaMKII ، ومع ذلك ، ربط كاميرا في وجود كميات عالية من الكالسيوم 2 + وسوف تنأى مرة كان بالكلاب والكالسيوم 2 +. ب) النتائج من كاميرا المثال المنسدلة مقايسة. هذا الرقم يدل على النتيجة النهائية المتوقعة من كام sepharose المنسدلة مع عينات للبحث نج وكناس CaMKII. كلا نج الذاتية وGFP NG - موجودة في ممرات للبروتينات ملزمة كاميرا في حضور EDTA. منضما لا نغ عندما يتم تحضين العينات مع كاميرا في وجود الكالسيوم 2 + ، مما يدل على أن Nز تلزم سوى الانفصال CAM. سيطرتنا إيجابية ، كناس CaMKII ، من ناحية أخرى ، يربط كاميرا فقط في وجود الكالسيوم 2 +.

<ol>
	<li>Vincenzi, F. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calmodulin+in+the+regulation+of+intracellular+calcium.">Calmodulin in the regulation of intracellular calcium.</a> Proc. West Pharmacol Soc. 22, 289-294 (1979).</li><li>Cheung, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calmodulin+plays+a+pivotal+role+in+cellular+regulation.">Calmodulin plays a pivotal role in cellular regulation.</a> Science. 207, 19-27 (1980).</li><li>Zhang, M., Tanaka, T., Ikura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-induced+conformational+transition+revealed+by+the+solution+structure+of+apo+calmodulin.">Calcium-induced conformational transition revealed by the solution structure of apo calmodulin.</a> Nat. Struct. Biol. 2, 758-767 (1995).</li><li>Alexander, K. A., Wakim, B. T., Doyle, G. S., Walsh, K. A., Storm, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+the+calmodulin-binding+domain+of+neuromodulin,+a+neurospecific+calmodulin-binding+protein.">Identification and characterization of the calmodulin-binding domain of neuromodulin, a neurospecific calmodulin-binding protein.</a> J. Biol. Chem. 263, 7544-7549 (1988).</li><li>Huang, K. P., Huang, F. L., Chen, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+7.5-kDa+protein+kinase+C+substrate+(RC3+protein,+neurogranin)+from+rat+brain.">Characterization of a 7.5-kDa protein kinase C substrate (RC3 protein, neurogranin) from rat brain.</a> Arch. Biochem. Biophys. 305, 570-580 (1993).</li><li>Bahler, M., Rhoads, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calmodulin+signaling+via+the+IQ+motif.">Calmodulin signaling via the IQ motif.</a> FEBS Lett. 513, 107-113 (2002).</li><li>Routtenberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+C+activation+leading+to+protein+F1+phosphorylation+may+regulate+synaptic+plasticity+by+presynaptic+terminal+growth.">Protein kinase C activation leading to protein F1 phosphorylation may regulate synaptic plasticity by presynaptic terminal growth.</a> Behav. Neural. Biol. 44, 186-200 (1985).</li><li>Zhong, L., Cherry, T., Bies, C. E., Florence, M. A., Gerges, N. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogranin+enhances+synaptic+strength+through+its+interaction+with+calmodulin.">Neurogranin enhances synaptic strength through its interaction with calmodulin.</a> EMBO J. 28, 3027-3039 (2009).</li><li>Needham, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+and+adenosinetriphosphate+in+relation+to+muscle+contraction.">Myosin and adenosinetriphosphate in relation to muscle contraction.</a> Biochim. Biophys. Acta. 4, 42-49 (1950).</li><li>Hathaway, D. R., Adelstein, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+platelet+myosin+light+chain+kinase+requires+the+calcium-binding+protein+calmodulin+for+activity.">Human platelet myosin light chain kinase requires the calcium-binding protein calmodulin for activity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76, 1653-1657 (1979).</li><li>Fukunaga, K., Yamamoto, H., Matsui, K., Higashi, K., Miyamoto, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+a+Ca2+-+and+calmodulin-dependent+protein+kinase+from+rat+brain.">Purification and characterization of a Ca2+- and calmodulin-dependent protein kinase from rat brain.</a> J. Neurochem. 39, 1607-1617 (1982).</li><li>Yang, S. D., Tallant, E. A., Cheung, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcineurin+is+a+calmodulin-dependent+protein+phosphatase.">Calcineurin is a calmodulin-dependent protein phosphatase.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 106, 1419-1425 (1982).</li><li>Huestis, W. H., Nelson, M. J., Ferrell, J. E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calmodulin-dependent+spectrin+kinase+activity+in+human+erythrocytes.">Calmodulin-dependent spectrin kinase activity in human erythrocytes.</a> Prog. Clin. Biol. Res. 56, 137-155 (1981).</li><li>Yamniuk, A. P., Vogel, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calmodulin's+flexibility+allows+for+promiscuity+in+its+interactions+with+target+proteins+and+peptides.">Calmodulin's flexibility allows for promiscuity in its interactions with target proteins and peptides.</a> Mol. Biotechnol. 27, 33-57 (2004).</li><li>Zhong, L., Kaleka, K. S., Gerges, N. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogranin+phosphorylation+fine-tunes+long-term+potentiation.">Neurogranin phosphorylation fine-tunes long-term potentiation.</a> Eur. J. Neurosci. 33, 244-250 (2011).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

البروتوكول شريطة يستخدم CAM - sepharose الخرز للتحقيق في كا 2 + الاعتماد على كاميرا ملزم البروتينات. العديد من البروتينات ربط كاميرا بطريقة تعتمد على الكالسيوم + 2. هذه التفاعلات هي ذات أهمية كبيرة نظرا لعدد CAM ملزم البروتينات ودورها الحيوي في العديد من مسارات الإ...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tr><td> المنتج </td><td> شركة </td><td> فهرس العدد </td><td> تلاحظ </td></tr><tr><td> كالمودولين - Sepharose الخرز </td><td> جنرال إلكتريك للرعاية الصحية </td><td> 17-0529-01 </td><td></td></tr><tr><td> المضادة للكناس CaMKII ألفا </td><td> سيغما الدريخ </td><td> C6974 </td><td></td></tr><tr><td> مكافحة neurogranin </td><td> ميليبور </td><td> 07-425 </td><td></td></tr><tr><td> نصائح هلام تحميل الماصة </td><td> الصياد </td><td> 02-707-138 </td><td> استخدامه لتطلع supernatants </td></tr><tr><td> أنابيب Microcentrifuge (2.0 مل) </td><td> الصياد </td><td> 05-408-146 </td><td> استخدام لجميع الخطوات التي تنطوي على كالمودولين - sepharose الخرز </td></tr></table>

pull-down of calmodulin-binding proteins

الكالسيوم (كا 2 +) هو ايون حيويا في تنظيم وظيفة الخلوية من خلال مجموعة متنوعة من الآليات. الكثير من الكالسيوم 2 + هو بوساطة من خلال إشارات البروتين الكالسيوم الملزمة المعروفة 1،2 (CAM) كالمودولين. وتشارك CAM على مستويات متعددة في جميع العمليات الخلوية تقريبا ، بما في ذلك موت الخلايا المبرمج ، والتمثيل الغذائي ، على نحو سلس تقلص العضلات ، اللدونة متشابك والنمو العصبي ، والتهاب والاستجابة المناعية. وهناك عدد من البروتينات تساعد على تنظيم هذه المسارات من خلال تفاعلها مع كاميرا. كثير من هذه التفاعلات تعتمد على التشكل من كاميرا ، والتي تختلف اختلافا واضحا عندما منضما إلى الكالسيوم 2 + (كا 2 + - CAM) مقابل حالته + خالية كا 2 (ApoCaM) 3. في حين أن معظم البروتينات الهدف ربط كا 2 + كام ، ربط بروتينات معينة فقط لApoCaM. كاميرا من خلال ربط بعض المجال الذكاء ، بما في ذلك neuromodulin 4 ، neurogranin (نغ) 5 ، وبعض myosins <sup&gt; 6. وقد تبين أن هذه البروتينات تلعب دورا هاما في وظيفة قبل المشبكي 7 ، 8 وظيفة بعد المشبكي ، وتقلص العضلات 9 ، على التوالي. قدرتها على ربط وإطلاق كاميرا في غياب أو وجود الكالسيوم 2 + لها دور محوري في وظيفتها. في المقابل ، ربط العديد من البروتينات فقط كا 2 + - CAM ، وتتطلب هذه ملزمة لتفعيلها. وتشمل الأمثلة على ضوء سلسلة الميوسين كيناز 10 ، كا 2 + / CAM التي تعتمد على كاينيسات (CaMKs) 11 وphosphatases (مثل الكالسينيورين (calcineurin)) 12 ، وإسبكترن كيناز 13 ، التي لديها مجموعة متنوعة من الآثار المباشرة والمصب 14. الآثار المترتبة على هذه البروتينات الخلوية على وظيفة غالبا ما تعتمد على قدرتها على ربط كاميرا بطريقة تعتمد على الكالسيوم + 2. على سبيل المثال ، نحن اختبار مدى ملاءمة NG - CAM ملزمة في وظيفة متشابك وكيف تؤثر هذه الطفرات المختلفة ملزمة. ولدت لدينا يخدع نغ GFP الموسومةالبنية مع طفرات معينة في المجال الذكاء من شأنها أن تغير قدرة نغ لربط كاميرا بطريقة تعتمد على الكالسيوم + 2. وقدم دراسة هذه الطفرات المختلفة لنا نظرة كبيرة في عمليات هامة تشارك في وظيفة متشابك 8،15. ومع ذلك ، في مثل هذه الدراسات ، فمن الضروري أن تثبت أن البروتينات المتحورة والربط المتوقع تغييرها لكاميرا. هنا ، نقدم طريقة لاختبار قدرة البروتينات لربط كاميرا في وجود أو عدم وجود الكالسيوم 2 + ، وذلك باستخدام وكناس CaMKII نغ كأمثلة. هذا الأسلوب هو شكل من أشكال التقارب اللوني ويشار إلى مقايسة المنسدلة CAM. ويستخدم CAM - Sepharose الخرز لاختبار البروتينات التي تربط لكاميرا وتأثير الكالسيوم 2 + على هذا الربط. حان الوقت أكثر من ذلك بكثير ويتطلب كفاءة وأقل من البروتين بالنسبة إلى العمود اللوني وفحوصات أخرى. تماما ، وهذا يوفر أداة قيمة لاستكشاف كا 2 + / CAM إشارات والبروتينات التي فيteract مع كاميرا.

Watch this Scientific Journal Video about Pull-down of Calmodulin-binding Proteins at JoVE.com

Pull-down of Calmodulin-binding Proteins

كالمودولين (CAM) المنسدلة مقايسة هو وسيلة فعالة لتحقيق التفاعل بين كام مع البروتينات المختلفة. يستخدم هذا الأسلوب CAM - sepharose الخرز لتحليل كفاءة والمحددة للكاميرا ملزم البروتينات. وهذا يوفر أداة مهمة لاستكشاف إشارات كاميرا في وظيفة الخلوية.

المنسدلة من كالمودولين ملزم البروتينات

Calcium (Ca2+) is an ion vital in regulating cellular function through a variety of mechanisms. Much of Ca2+ signaling is mediated through the ...

Research

JoVE Journal

Biology

25.2K Views.  Medical College of Wisconsin. كالمودولين (CAM) المنسدلة مقايسة هو وسيلة فعالة لتحقيق التفاعل بين كام مع البروتينات المختلفة. يستخدم هذا الأسلوب CAM - sepharose الخرز لتحليل كفاءة والمحددة للكاميرا ملزم البروتينات. وهذا يوفر أداة مهمة لاستكشاف إشارات كاميرا في وظيفة الخلوية.

Video: Pull-down of Calmodulin-binding Proteins

Electrophoretic Separation of Proteins

Electrophoresis is used to separate complex mixtures of proteins (e.g., from cells, subcellular fractions, column fractions, or immunoprecipitates), to investigate subunit compositions, and to verify homogeneity of protein samples. It can also serve to purify proteins for use in further applications. In polyacrylamide gel electrophoresis, proteins migrate in response to an electrical field through pores in a polyacrylamide gel matrix; pore size decreases with increasing acrylamide concentration. The combination of pore size and protein charge, size, and shape determines the migration rate of the protein. In this unit, the standard Laemmli method is described for discontinuous gel electrophoresis under denaturing conditions, i.e., in the presence of sodium dodecyl sulfate (SDS). 

In this video, we demonstrate a method for electrophoretic separation of proteins using poly-acrylimide gel electrophoresis (PAGE).

الكهربي فصل البروتينات

Electrophoresis is used to separate complex mixtures of proteins (e.g., from cells, subcellular fractions, column fractions, or immunoprecipitates), to ...

Staining Proteins in Gels

Following separation by electrophoretic methods, proteins in a gel can be detected by several staining methods. This unit describes protocols for detecting proteins by four popular methods. Coomassie blue staining is an easy and rapid method. Silver staining, while more time consuming, is considerably more sensitive and can thus be used to detect smaller amounts of protein. Fluorescent staining is a popular alternative to traditional staining procedures, mainly because it is more sensitive than Coomassie staining, and is often as sensitive as silver staining. Staining of proteins with SYPRO Orange and SYPRO Ruby are also demonstrated here.

Following separation by electrophoretic methods, proteins in a gel can be detected by several staining methods. Staining of proteins with Coomassie Blue, Silver Staining, SYPRO Orange, SYPRO Ruby are demonstrated in this video.

تلطيخ البروتينات في الهلام

Following separation by electrophoretic methods, proteins in a gel can be detected by several staining methods. This unit describes protocols for ...

Microcontact Printing of Proteins for Cell Biology

The ability to pattern proteins and other biomolecules onto substrates is important for capturing the spatial complexity of the extracellular environment. Development of microcontact printing by the Whitesides group (<a href="http://gmwgroup.harvard.edu/">http://gmwgroup.harvard.edu/</a>) in the mid-1990s revolutionalized this field by making microelectronics/microfabrication techniques accessible to laboratories focused on the life sciences. Initial implementations of this method used polydimethylsiloxane (PDMS) stamps to create patterns of functionalized chemicals on material surfaces1. Since then, a range of innovative approaches have been developed to pattern other molecules, including proteins2. This video demonstrates the basic process of creating PDMS stamps and uses them to pattern proteins, as these steps are difficult to accurately express in words. We focus on patterning the extracellular matrix protein fibronectin onto glass coverslips as a specific example of patterning.
An important component of the microcontact printing process is a topological master, from which the stamps are cast; the raised and lowered regions of the master are mirrored into the stamp and define the final pattern. Typically, a master consists of a silicon wafer coated with photoresist and then patterned by photolithography, as is done here. Creation of masters containing a specific pattern requires specialized equipment, and is best approached in consultation with a fabrication center or facility. However, almost any substrate with topology can be used as a master, such as plastic diffraction gratings (see Reagents for one example), and such serendipitous masters provide readily available, simple patterns. This protocol begins at the point of having a master in hand.

Microcontact printing is used extensively to pattern proteins and other molecules on material surfaces. We demonstrate the basic steps of this process, stamping patterns of fibronectin onto glass.

الطبعة Microcontact من البروتينات لبيولوجيا الخلية

The ability to pattern proteins and other biomolecules onto substrates is important for capturing the spatial complexity of the extracellular environment. ...

Expression of Recombinant Proteins in the Methylotrophic Yeast Pichia pastoris

Protein expression in the microbial eukaryotic host Pichia pastoris offers the possibility to generate high amounts of recombinant protein in a fast and easy to use expression system.
As a single-celled microorganism P. pastoris is easy to manipulate and grows rapidly on inexpensive media at high cell densities. Being a eukaryote, P. pastoris is able to perform many of the post-translational modifications performed by higher eukaryotic cells and the obtained recombinant proteins undergo protein folding, proteolytic processing, disulfide bond formation and glycosylation [1].
As a methylotrophic yeast P. pastoris is capable of metabolizing methanol as its sole carbon source. The strong promoter for alcohol oxidase, AOX1, is tightly regulated and induced by methanol and it is used for the expression of the gene of interest. Accordingly, the expression of the foreign protein can be induced by adding methanol to the growth medium [2; 3].
Another important advantage is the secretion of the recombinant protein into the growth medium, using a signal sequence to target the foreign protein to the secretory pathway of P. pastoris. With only low levels of endogenous protein secreted to the media by the yeast itself and no added proteins to the media, a heterologous protein builds the majority of the total protein in the medium and facilitates following protein purification steps [3; 4].
The vector used here (pPICZ&alpha;A) contains the AOX1 promoter for tightly regulated, methanol-induced expression of the gene of interest; the &alpha;-factor secretion signal for secretion of the recombinant protein, a Zeocin resistance gene for selection in both E. coli and Pichia and a C-terminal peptide containing the c-myc epitope and a polyhistidine (6xHis) tag for detection and purification of a recombinant protein. We also show western blot analysis of the recombinant protein using the specific Anti-myc-HRP antibody recognizing the c-myc epitope on the parent vector.

Expression of Recombinant Proteins in the Methylotrophic Yeast Pichia pastoris

The protocol describes protein expression using the methylotrophic yeast Pichia pastoris. The preparation of electrocompetent yeast cells, transformation of the vector with the gene of interest into P. pastoris and yeast DNA purification are also performed. Western blot analysis and protein purification build the last steps in this protein expression protocol.

التعبير عن البروتينات المؤتلف في الخميرة Methylotrophic Pichia pastoris</em

Protein expression in the microbial eukaryotic host Pichia pastoris offers the possibility to generate high amounts of recombinant protein in a fast and ...

Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are implicated in a multitude of malfunctions and diseases. However, a structural and functional understanding of membrane proteins is strongly lagging behind that of their soluble partners, mainly, due to difficulties associated with their solubilization and generation of diffraction quality crystals. Crystallization in lipidic mesophases (also known as in meso or LCP crystallization) is a promising technique which was successfully applied to obtain high resolution structures of microbial rhodopsins, photosynthetic proteins, outer membrane beta barrels and G protein-coupled receptors. In meso crystallization takes advantage of a native-like membrane environment and typically produces crystals with lower solvent content and better ordering as compared to traditional crystallization from detergent solutions. The method is not difficult, but requires an understanding of lipid phase behavior and practice in handling viscous mesophase materials. Here we demonstrate a simple and efficient way of making LCP and reconstituting a membrane protein in the lipid bilayer of LCP using a syringe mixer, followed by dispensing nanoliter portions of LCP into an assay or crystallization plate, conducting pre-crystallization assays and harvesting crystals from the LCP matrix. These protocols provide a basic guide for approaching in meso crystallization trials; however, as with any crystallization experiment, extensive screening and optimization are required, and a successful outcome is not necessarily guaranteed.

The protocols describe the essential steps for obtaining diffraction quality crystals of a membrane protein starting from reconstitution of the protein in a lipidic cubic phase (LCP), finding initial conditions with LCP-FRAP pre-crystallization assays, setting up LCP crystallization trials and harvesting crystals.

بلورة البروتينات في الغشاء Mesophases Lipidic

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are ...

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further biochemical analyses to obtain detailed insights into structure/function relationships. Advances in oligonucleotide- and gene synthesis technology make large-scale mutagenesis strategies increasingly feasible, including the substitution of target residues by all 19 other amino acids. Gain- or loss-of-function phenotypes then allow systematic conclusions to be drawn, such as the contribution of particular residues to catalytic activity, protein stability and/or protein-protein interaction specificity.
In order to attribute the different phenotypes to the nature of the mutation - rather than to fluctuating experimental conditions - it is vital to purify and analyse the proteins in a controlled and reproducible manner. High-throughput strategies and the automation of manual protocols on robotic liquid-handling platforms have created opportunities to perform such complex molecular biological procedures with little human intervention and minimal error rates1-5.
Here, we present a general method for the purification of His-tagged recombinant proteins in a high-throughput manner. In a recent study, we applied this method to a detailed structure-function investigation of TFIIB, a component of the basal transcription machinery. TFIIB is indispensable for promoter-directed transcription in vitro and is essential for the recruitment of RNA polymerase into a preinitiation complex6-8. TFIIB contains a flexible linker domain that penetrates the active site cleft of RNA polymerase9-11. This linker domain confers two biochemically quantifiable activities on TFIIB, namely (i) the stimulation of the catalytic activity during the 'abortive' stage of transcript initiation, and (ii) an additional contribution to the specific recruitment of RNA polymerase into the preinitiation complex4,5,12 . We exploited the high-throughput purification method to generate single, double and triple substitution and deletions mutations within the TFIIB linker and to subsequently analyse them in functional assays for their stimulation effect on the catalytic activity of RNA polymerase4. Altogether, we generated, purified and analysed 381 mutants - a task which would have been time-consuming and laborious to perform manually. We produced and assayed the proteins in multiplicates which allowed us to appreciate any experimental variations and gave us a clear idea of the reproducibility of our results.
This method serves as a generic protocol for the purification of His-tagged proteins and has been successfully used to purify other recombinant proteins. It is currently optimised for the purification of 24 proteins but can be adapted to purify up to 96 proteins.

We describe a method for the affinity-tagged purification of recombinant proteins using liquid-handling robotics. This method is generally applicable to the small-scale purification of soluble His-tagged proteins in a high-throughput format.

عالية الإنتاجية تنقية تقارب الموسومة البروتينات المؤتلف

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

The Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating fundamental questions such as cytoskeletal function, cell organization, and organelle structure and function. The availability of various GFP-tagged proteins means that many cellular processes can be monitored in living cells over the course of minutes or hours, and using this technique, processes such as RNP transport, epithelial morphogenesis, and tissue remodeling have been described in great detail in Drosophila oocytes1,2.
The ability to perform video imaging combined with a rich repertoire of mutants allows an enormous variety of genes and processes to be examined in incredible detail. One such example is the process of ooplasmic streaming, which initiates at mid-oogenesis3,4. This vigorous movement of cytoplasmic vesicles is microtubule and kinesin-dependent5 and provides a useful system for investigating cytoskeleton function at these stages.
Here I present a protocol for time lapse imaging of living oocytes using virtually any confocal microscopy setup.

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

A protocol for live imaging of GFP-tagged proteins or autofluorescent structures in individual Drosophila oocytes is described.

يعيش التصوير من البروتينات التي تحمل علامات GFP في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; البويضات

The  Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating  fundamental questions such as cytoskeletal function, cell ...

Rapid Generation of Amyloid from Native Proteins In vitro

Proteins carry out crucial tasks in organisms by exerting functions elicited from their specific three dimensional folds. Although the native structures of polypeptides fulfill many purposes, it is now recognized that most proteins can adopt an alternative assembly of beta-sheet rich amyloid. Insoluble amyloid fibrils are initially associated with multiple human ailments, but they are increasingly shown as functional players participating in various important cellular processes. In addition, amyloid deposited in patient tissues contains nonproteinaceous components, such as nucleic acids and glycosaminoglycans (GAGs). These cofactors can facilitate the formation of amyloid, resulting in the generation of different types of insoluble precipitates. By taking advantage of our understanding how proteins misfold via an intermediate stage of soluble amyloid precursor, we have devised a method to convert native proteins to amyloid fibrils in vitro. This approach allows one to prepare amyloid in large quantities, examine the properties of amyloid generated from specific proteins, and evaluate the structural changes accompanying the conversion.

Rapid Generation of Amyloid from Native Proteins In vitro

Proteins can either adopt a native structure or misfold into insoluble amyloid. Conditions that favor the misfolding pathway lead to the formation of different types of amyloid fibrils. The methods described here allow rapid conversion of native proteins into amyloid in vitro.

Proteins carry out crucial tasks in organisms by exerting functions elicited from their specific three dimensional folds. Although the native structures ...

Transient Expression of Proteins by Hydrodynamic Gene Delivery in Mice

Efficient expression of transgenes in vivo is of critical importance in studying gene function and developing treatments for diseases. Over the past years, hydrodynamic gene delivery (HGD) has emerged as a simple, fast, safe and effective method for delivering transgenes into rodents. This technique relies on the force generated by the rapid injection of a large volume of physiological solution to increase the permeability of cell membranes of perfused organs and thus deliver DNA into cells. One of the main advantages of HGD is the ability to introduce transgenes into mammalian cells using naked plasmid DNA (pDNA). Introducing an exogenous gene using a plasmid is minimally laborious, highly efficient and, contrary to viral carriers, remarkably safe. HGD was initially used to deliver genes into mice, it is now used to deliver a wide range of substances, including oligonucleotides, artificial chromosomes, RNA, proteins and small molecules into mice, rats and, to a limited degree, other animals. This protocol describes HGD in mice and focuses on three key aspects of the method that are critical to performing the procedure successfully: correct insertion of the needle into the vein, the volume of injection and the speed of delivery. Examples are given to show the application of this method to the transient expression of two genes that encode secreted, primate-specific proteins, apolipoprotein L-I (APOL-I) and haptoglobin-related protein (HPR).

In vivo transfection of naked DNA by hydrodynamic gene delivery introduces genes into the tissue of an animal with minimal inflammatory response. Sufficient amounts of gene product are generated such that gene function and regulation as well as protein structure and function can be analyzed.

التعبير عابرة من البروتينات عن طريق هيدرودينامي الجينات في الفئران التسليم

Efficient expression of transgenes in vivo is of critical importance in studying gene function and developing treatments for diseases. Over the past ...

Immunofluorescence Analysis of Endogenous and Exogenous Centromere-kinetochore Proteins

"Centromeres" and "kinetochores" refer to the site where chromosomes associate with the spindle during cell division. Direct visualization of centromere-kinetochore proteins during the cell cycle remains a fundamental tool in investigating the mechanism(s) of these proteins. Advanced imaging methods in fluorescence microscopy provide remarkable resolution of centromere-kinetochore components and allow direct observation of specific molecular components of the centromeres and kinetochores. In addition, methods of indirect immunofluorescent (IIF) staining using specific antibodies are crucial to these observations. However, despite numerous reports about IIF protocols, few discussed in detail problems of specific centromere-kinetochore proteins.1-4 Here we report optimized protocols to stain endogenous centromere-kinetochore proteins in human cells by using paraformaldehyde fixation and IIF staining. Furthermore, we report protocols to detect Flag-tagged exogenous CENP-A proteins in human cells subjected to acetone or methanol fixation. These methods are useful in detecting and quantifying endogenous centromere-kinetochore proteins and Flag-tagged CENP-A proteins, including those in human cells.

Here we report protocols to detect endogenous and exogenous centromere-kinetochore proteins in human cells and quantify these protein levels at centromeres-kinetochores by indirect immunofluorescent staining through the use of fixation (paraformaldehyde, acetone, or methanol fixation).