هذا البروتوكول مفيد لإجراء التلاعب الجيني على البكتيريا التكافلية ، في هذه الحالة ، وتحديدا على Burkholderia ، وتحديد الجينات الضرورية لاستعمار مضيف الحشرات. تسلسل الإدراج Transposon هو أداة قوية لتحديد عدد كبير من الجينات الأساسية مشروط في وقت واحد في تجربة واحدة. تبدأ عن طريق تلقيح ثقافة مانحة جديدة من المانحين E.coli في 10 ملليلتر من LB المتوسطة تكملها Kanamycin وDAP تحت غطاء محرك السيارة العقيمة.
تلقيح Burkholderia gladioli سلالة الخلايا المتلقية في خمسة ملليلتر من المتوسط كيلوبايت. احتضان الثقافات في 30 درجة مئوية بين عشية وضحاها على شاكر في 250 دورة في الدقيقة. بعد النمو بين عشية وضحاها، والطرد المركزي أربعة ملليلتر من كل من الثقافات في 9، 600 مرة G لمدة ست دقائق بيليه الخلايا والتخلص من supernatant.
تحت غطاء محرك السيارة العقيم، اغسل ثقافات الخلايا الحبيبية في وسيط KB يحتوي على DAP. وأخيرا، إعادة إنفاق الثقافات بشكل منفصل في أربعة ملليلترات من كيلوبايت بالإضافة إلى DAP المتوسطة. في أنبوب جديد 15 ملليلتر، مزيج 250 ميكرولتر من الخلايا المانحة E.coli غسلها مع ملليلتر واحد من سلالة بوركيهولديريا غلاديولي غسلها الخلايا المتلقية.
بقعة 10 ميكرولتر من هذا خليط خلايا اقتران على لوحات أجار كيلو بايت التي تحتوي على DAP. السماح للوح للراحة دون عائق في غطاء محرك السيارة العقيمة في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. احتضان لوحات مع البقع اقتران في 30 درجة مئوية لمدة 12 إلى 18 ساعة.
بعد الحضانة، إضافة 2-4 ملليلتر من برنامج تلفزيوني 1X على لوحات تحت غطاء محرك السيارة العقيمة واستخدام مكشطة الخلية للافراج عن البقع اقتران البكتيرية نمت من أجار. ثم ماصة مزيج الخلية المترافقة في اثنين من أنابيب الميكروفون ملليلتر. بيليه الخلايا عن طريق الطرد المركزي في 9، 600 مرة G لمدة دقيقتين.
تجاهل supernatant وغسل بيليه مرتين في ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني 1X عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا. Resuspend بيليه النهائي في 1، 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني 1X. تخلط جيدا وتنتشر 100 ميكرولتر من خليط الخلية على لوحات كبيرة كيلوبايت أجار تكملها Kanamycin واحتضان في 30 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
عد العدد الإجمالي للمستعمرات العابرة على الصفائح الثلاث واستقراء لحساب العدد التقريبي للمسوخ التي تم الحصول عليها في جميع الصفائح. لزيادة فرص الحصول على مكتبة تمثيلية، تأكد من أن العدد الإجمالي للمستعمرات أعلى بعدة أضعاف من العدد الإجمالي للجينات في الجينوم. لتأكيد نجاح عملية التواؤم، قم بإجراء PCR يستهدف كاسيت الإدراج باستخدام 10 إلى 20 مستعمرة عينة كما هو موضح في المخطوطة.
تحت غطاء محرك السيارة العقيم، كشط المستعمرات من لوحات بإضافة 1 إلى اثنين من ملليلتر من برنامج تلفزيوني 1X على أجار. تجمع خليط الخلية كشط قبالة من لوحات في أنابيب 50 ملليلتر. دوامة المكتبة لخلط جيدا، ومن ثم تقسيم ملليلتر واحد من مكتبة متحولة مجمعة في عدة أنابيب التبريد.
إضافة ملليلتر واحد من 70٪ الجليسيرول إلى الأنابيب وتخزينها في ناقص 80 درجة مئوية. حدد مخلب البيض L.villosa وعدد البيض المستمر إذا كان القابض يحتوي على أكثر من 100 بيضة. لتعقيم مخلب البيض بأكمله، أضف 200 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 70٪، واغسل البيض برفق لمدة خمس دقائق، ثم أزيل الإيثانول واغسل البيض مرتين بالماء المعبئ.
أضف 200 ميكرولتر من التبييض بنسبة 12٪، واغسل البيض برفق لمدة 30 ثانية. إزالة التبييض على الفور وغسل البيض مرة أخرى ثلاث مرات مع 200 ميكرولتر من الماء autoclaved. تصيب البيض في مخلب البيض المعقم باستخدام مرتين 10 إلى الخلايا الست لكل ميكرولتر من مكتبة متحولة غسلها في برنامج تلفزيوني.
بعد يومين من فتحة يرقات الخنفساء المصابة ، اجمع 100 يرقات نجم ثانية لكل أنبوب ميكروفوجي 1.5 ملليلتر وتخزينها عند ناقص 80 درجة مئوية. لتوليد مكتبة التحكم في المختبر، تلقيح 250 ميكرولتر من مرتين 10 إلى ست خلايا لكل ميكرولتر من المكتبة المتحولة في 10 ملليلتر من متوسط KB يحتوي على كاناميسين. بعد استخراج الحمض النووي من في الجسم الحي وفي المختبر نمت المكتبات متحولة، وتبادل الحمض النووي مع ultrasonicator.
للتحقق مما إذا كان الحمض النووي قد تم قصه إلى نطاق الحجم المطلوب ، قم بتحميل خمسة ميكرولترات من الحمض النووي غير المقص والمقص بعد خلطه مع صبغة تحميل الجل بنسبة واحد إلى واحد على هلام agarose 1.6٪ يعمل عند 250 فولت لمدة 40 دقيقة. لإعداد نهايات الجزء المطلوبة ربط محول، تبدأ بإضافة ثلاثة ميكرولترات من مزيج الانزيم وسبعة ميكرولترات من العازلة رد فعل إلى 50 ميكرولتر من الحمض النووي القص وتخلط بشكل جيد عن طريق pipetting. تعيين thermocycler مع غطاء ساخن في أكبر من أو يساوي 75 درجة مئوية واحتضان العينات لمدة 30 دقيقة في 20 درجة مئوية و 30 دقيقة في 65 درجة مئوية، ثم عقد درجة الحرارة في أربع درجات مئوية.
ربط محول، إضافة 30 ميكرولتر من مزيج الربط الرئيسي، ميكرولتر واحد من محسن الربط، و 2.5 ميكرولتر من محول المخفف لمنتجات خطوة إعداد نهاية. تخلط جيدا عن طريق pipetting واحتضان العينة لمدة 15 دقيقة في 20 درجة مئوية في thermocycler مع غطاء ساخنة قبالة. بعد 15 دقيقة، أضف ثلاثة ميكرولترات من الإنزيم.
تخلط جيدا عن طريق pipetting واحتضان العينة لمدة 15 دقيقة في 37 درجة مئوية في thermocycler مع غطاء ساخنة في أكبر من أو يساوي 47 درجة مئوية. لتحديد حجم محول الحمض النووي ربط استهداف شظايا من 250 أزواج قاعدة، تبدأ دوامة حل حبة المغناطيسي ووضعه في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة قبل الاستخدام. إضافة 0.3 مرات من الخرز إلى 96.5 ميكرولتر من خليط الحمض النووي ربطها وتخلط عن طريق الأنابيب جيدا.
احتضان خليط الخرز لمدة خمس دقائق. ضع الأنابيب على حامل مغناطيسي لسحب الخرز وإزالة شظايا الحمض النووي من الحجم غير المرغوب فيه. دع الخرز يستقر لمدة خمس دقائق ثم نقل النافورة واضحة إلى أنبوب ميكروفوج جديدة.
إضافة 0.15 مرات من الخرز الطازج إلى supernatant وتخلط عن طريق pipetting جيدا. احتضان خليط الخرز لمدة خمس دقائق ومن ثم وضع الأنابيب على موقف المغناطيسي لسحب أسفل الخرز ملزمة الحمض النووي الهدف. انتظر لمدة خمس دقائق ثم تجاهل supernatant، والحفاظ على الخرز.
مع الخرز على المنصة المغناطيسية، إضافة 200 ميكرولتر من الإيثانول الطازجة 80٪، وانتظر لمدة 30 ثانية قبل التخلص من الإيثانول دون إزعاج الخرز. إزالة الأنابيب من المنصة وإضافة 17 ميكرولتر من 0.1X TE أو TE منخفضة، ثم مزيج عن طريق pipetting 10 مرات واحتضان الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقتين. ضع الأنبوب على الحامل المغناطيسي و خذ 15 ميكرولتر من الحمض النووي المحدد بالحجم ل PCR-1.
دوامة حبات streptavidin ووضعها في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة على الأقل. خذ 32 ميكرولتر من الخرز واغسلها ب 500 ميكرولتر من 1X ربط وغسل العازلة. إضافة 32 ميكرولتر من 2X ربط وغسل العازلة وإعادة إنفاق الخرز.
لهذا، إضافة 32 ميكرولتر من منتجات PCR-1 تنظيفها. تخلط جيدا واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. ضع خليط الحمض النووي حبة على موقف المغناطيسي لمدة دقيقتين.
ماصة من supernatant كما الحمض النووي البيوتين الموسومة التي تحتوي على حافة الإدراج يربط إلى streptavidin على الخرز. غسل الخرز مع 500 ميكرولتر من ربط 1X وغسل العازلة، ومن ثم غسل الخرز مع 200 ميكرولتر من TE منخفضة. Resuspend حبات الحمض النووي ملزمة في 17 ميكرولتر من TE منخفضة. الحمض النووي للمكتبات المتحولة في الجسم الحي وفي المختبر نمت استخراج ومجزأة في ultrasonicator أظهرت غالبية شظايا تمتد بين 100 و 400 أزواج قاعدة. يمكن ملاحظة موقع عمليات الإدراج بوساطة الإرسال والاستقبال عبر أربعة replicons من سلالة Burkholderia gladioli الجينوم A في جراب.
ويمكن ملاحظة ملخص لإخراج التسلسل وعدد عمليات الإدراج والجينات الفريدة التي ضربت في التكاثر الثلاث في المكتبات الحية وفي المختبر في الجدول. الشيء المهم هو أن نتذكر لحساب حجم عنق الزجاجة السكان خلال الاستعمار المضيف للحصول على تمثيل مناسب للمكتبة أثناء العدوى. أيضا، ضبط لعدد متوافق من الأجيال البكتيرية في المختبر وفي المضيف.
بعد إنشاء مكتبة متحولة transposon ، يمكن فحصها على وسائل الإعلام الانتقائية لاستعادة المسوخ على أساس الاختلافات الظاهرية. وبالتالي يمكن تحديد جينات محددة مهمة لحالة ما.
