Этот протокол полезен для выполнения генетических манипуляций с симбиотическими бактериями, в данном случае, в частности, с буркхолдерией, и идентификации генов, необходимых для колонизации насекомого-хозяина. Транспозонное вставное секвенирование является мощным инструментом для идентификации большого количества условно необходимых генов одновременно в одном эксперименте. Начните с прививки свежей донорской культуры донора E.coli в 10 миллилитрах среды LB, дополненной канамицином и DAP под стерильным капюшоном.
Инокулируют штамма гладиолусов Burkholderia A в клетках-реципиентах в пяти миллилитрах среды KB. Инкубировать культуры при 30 градусах Цельсия в течение ночи на шейкере при 250 оборотах в минуту. После ночного роста центрифугируют четыре миллилитра каждой из культур по 9, 600 раз G в течение шести минут, чтобы гранулировать клетки и выбросить супернатант.
Под стерильным капюшоном промыть гранулированные клеточные культуры в среде KB, содержащей DAP. И, наконец, повторно суспендировали культуры отдельно в четырех миллилитрах KB плюс DAP среда. В свежей 15-миллилитровой трубке смешайте 250 микролитров промытых донорских клеток E.coli с одним миллилитром промытых клеток реципиента штамма гладиолусов Burkholderia.
Надень 10 микролитров этой смеси конъюгационных клеток на пластинах агара KB, содержащих DAP. Дайте пластине спокойно отдохнуть в стерильной вытяжке при комнатной температуре в течение одного часа. Инкубировать пластины с пятнами сопряжения при 30 градусах Цельсия в течение 12-18 часов.
После инкубации добавьте от двух до четырех миллилитров 1X PBS на пластины под стерильным капюшоном и используйте клеточный скребок, чтобы освободить выращенные бактериальные конъюгационные пятна из агара. Затем пипетку конъюгированной ячейки смешивают в две миллилитровые микрофьюжетные трубки. Гранулируют ячейки центрифугированием при 9, 600 раз G в течение двух минут.
Выбросьте супернатант и промыть гранулу дважды в одном миллилите 1X PBS путем пипетки вверх и вниз. Повторное суспендирование конечной гранулы в 1 200 микролитрах 1X PBS. Хорошо перемешайте и наложите 100 микролитров клеточной смеси на большие пластины агара KB, дополненные канамицином, и инкубировать при 30 градусах Цельсия в течение ночи.
Подсчитайте общее количество трансконъюгантных колоний на трех пластинах и экстраполируйте, чтобы вычислить приблизительное количество мутантов, полученных во всех пластинах. Чтобы увеличить шансы на получение репрезентативной библиотеки, убедитесь, что общее количество колоний в несколько раз превышает общее количество генов в геноме. Чтобы подтвердить успех сопряжения, выполните ПЦР, нацеленную на вставную кассету, используя от 10 до 20 колоний образцов, как описано в рукописи.
Под стерильным капотом соскоблите колонии с пластин, добавив один-два миллилитра 1X PBS на агар. Смешанный с пластин клеточной смеси сваливают в 50-миллилитровые трубки. Вихрьте библиотеку, чтобы тщательно перемешать, а затем разделите один миллилитр объединенной библиотеки мутантов на несколько криотрубок.
Добавьте в тубы один миллилитр 70% глицерина и храните при минус 80 градусах Цельсия. Выберите яичную кладку L.villosa и подсчитайте количество яиц, если кладка содержит более 100 яиц. Чтобы стерилизовать всю яичную кладку, добавьте 200 микролитров 70% этанола и аккуратно вымойте яйца в течение пяти минут, затем удалите этанол и дважды вымойте яйца автоклавной водой.
Добавьте 200 микролитров 12% отбеливателя и аккуратно вымойте яйца в течение 30 секунд. Немедленно удалите отбеливатель и снова вымойте яйца еще раз 200 микролитрами автоклавной воды. Заразить яйца в стерилизованной кладке яиц, используя от двух до шести клеток на микролитр вымытой библиотеки мутантов в PBS.
Через два дня после того, как зараженные личинки жука вылупляются, соберите 100-секундных личинок в 1,5-миллилитровой микрофьюжной трубке и храните при минус 80 градусах Цельсия. Чтобы создать контрольную библиотеку in vitro, привите 250 микролитров в два раза по 10 до шести клеток на микролитр мутантной библиотеки в 10 миллилитрах среды KB, содержащей канамицин. После извлечения ДНК из библиотек мутантов, выращенных in vivo и in vitro, поделитесь ДНК с ультразвуковым аппаратом.
Чтобы проверить, была ли ДНК срезана до желаемого диапазона размеров, загрузите пять микролитров нестрепаемой и стриженной ДНК после смешивания с гелевым нагрузочным красителем в соотношении один к одному на 1,6% агарозном геле при 250 вольтах в течение 40 минут. Чтобы подготовить концы фрагмента, необходимые для перевязки адаптера, начните с добавления трех микролитров ферментной смеси и семи микролитров реакционного буфера к 50 микролитрам срезаной ДНК и хорошо перемешайте путем пипетирования. Установите термоциклер с нагретой крышкой при температуре более или равной 75 градусам Цельсия и инкубируют образцы в течение 30 минут при 20 градусах Цельсия и 30 минут при 65 градусах Цельсия, затем удерживайте температуру на уровне четырех градусов Цельсия.
Для лигирования адаптера добавьте 30 микролитров главной смеси лигирования, один микролитр усилителя лигирования и 2,5 микролитра разбавленного адаптера к продуктам конечной стадии приготовления. Тщательно перемешайте путем пипетки и инкубирует образец в течение 15 минут при 20 градусах Цельсия в термоциклере с подогретой крышкой. Через 15 минут добавьте три микролитра фермента.
Хорошо перемешайте путем пипетки и инкубирует образец в течение 15 минут при 37 градусах Цельсия в термоциклере с крышкой, нагретой при большем или равном 47 градусам Цельсия. Чтобы выбрать размер адаптера, лигатированной ДНК, нацеленной на фрагменты из 250 пар оснований, начните с вихревого раствора магнитного шарика и поместите его при комнатной температуре в течение 30 минут перед использованием. Добавьте 0,3 раза бусины к 96,5 микролитрам лигатированной смеси ДНК и тщательно перемешайте, пипетируя.
Инкубировать бисероплетение в течение пяти минут. Поместите трубки на магнитную подставку, чтобы стянуть бусины и удалить фрагменты ДНК нежелательного размера. Дайте бусинам отстояться в течение пяти минут, а затем перенесите прозрачный супернатант в новую микрофьюжную трубку.
Добавьте в супернатант 0,15 раза свежих бусин и хорошо перемешайте, пипетировка. Инкубировать смесь шариков в течение пяти минут, а затем поместить трубки на магнитную подставку, чтобы стянуть шарики, связанные с целевой ДНК. Подождите пять минут, а затем выбросьте супернатант, сохранив бусины.
Вытав бусины на магнитную подставку, добавьте 200 микролитров свежеприготовленного 80% этанола и подождите 30 секунд, прежде чем выбросить этанол, не потревожив бусины. Выньте трубки из подставки и добавьте 17 микролитров 0,1X TE или Low TE, затем перемешайте путем пипетки 10 раз и инкубируете смесь при комнатной температуре в течение двух минут. Поместите трубку на магнитную подставку и возьмите 15 микролитров выбранного размера ДНК для ПЦР-1.
Вихрь стрептавидиновые шарики и поместите их при комнатной температуре не менее чем на 30 минут. Возьмите 32 микролитра бусин и вымойте их 500 микролитрами 1X связывания и промывки буфера. Добавьте 32 микролитра 2X связывания и промывки буфера и повторно суспендирует бусины.
К этому добавьте 32 микролитра очищенных продуктов PCR-1. Тщательно перемешать и инкубировать при комнатной температуре в течение 30 минут. Поместите смесь ДНК шариков на магнитную подставку на две минуты.
Пипетка из супернатанта в виде биотин-помеченной ДНК, содержащей край вставки, связывается со стрептавидином на шариках. Вымойте бусины 500 микролитрами 1X связующего и промывного буфера, а затем вымойте бусины 200 микролитрами Low TE. Повторное суспендирование связанных с ДНК шариков в 17 микролитрах Low TE. ДНК библиотек мутантов in vivo и in vitro, извлеченных и фрагментированных в ультразвуковом аппарате, показала, что большинство фрагментов охватывают от 100 до 400 пар оснований. Расположение транспозонно-опосредованных вставок через четыре репликакона генома штамма гладиолусов Burkholderia A можно наблюдать в стручке.
В таблице можно поразить сводку результатов секвенирования и количество уникальных вставок и генов, поразивших три реплицируемые библиотеки in vivo и in vitro. Важно помнить, что необходимо рассчитать размер узкого места популяции во время колонизации хозяина, чтобы получить соответствующее представление о библиотеке во время заражения. Кроме того, скорректируйте для совместимого количества бактериальных поколений in vitro и в хозяине.
После генерации библиотеки транспозонных мутантов она может быть экранирована на селективных носителях для восстановления мутантов на основе фенотипических различий. Таким образом, могут быть идентифицированы специфические гены, важные для состояния.
