Este protocolo es útil para realizar la manipulación genética de bacterias simbióticas, en este caso, específicamente en Burkholderia, e identificar los genes esenciales para colonizar un insecto huésped. La secuenciación de inserción de transposones es una herramienta poderosa para identificar un gran número de genes condicionalmente esenciales simultáneamente en un solo experimento. Comience inoculando un cultivo de donante fresco de E. coli en 10 mililitros de medio LB suplementado con kanamicina y DAP bajo una capucha estéril.
Inocular células receptoras de la cepa A de gladiolos de Burkholderia en cinco mililitros de kb medio. Incubar los cultivos a 30 grados centígrados durante la noche en una coctelera a 250 RPM. Después del crecimiento durante la noche, centrífuga cuatro mililitros de cada uno de los cultivos a 9, 600 veces G durante seis minutos para peletizar las células y desechar el sobrenadante.
Bajo una capucha estéril, lave los cultivos celulares granulados en un medio KB que contenga DAP. Y finalmente, resuspend los cultivos por separado en cuatro mililitros de KB más medio DAP. En un tubo fresco de 15 mililitros, mezcle 250 microlitros de las células donantes de E. coli lavadas con un mililitro de las células receptoras de burkholderia gladioli cepa A lavadas.
Detecte 10 microlitros de esta mezcla de células de conjugación en placas de agar KB que contienen DAP. Deje que la placa descanse sin ser molestada en la campana estéril a temperatura ambiente durante una hora. Incubar las placas con los puntos de conjugación a 30 grados centígrados durante 12 a 18 horas.
Después de la incubación, agregue de dos a cuatro mililitros de 1X PBS en las placas debajo de una capucha estéril y use un raspador celular para liberar las manchas de conjugación bacterianas cultivadas del agar. Luego pipetee la mezcla de células conjugadas en dos tubos de microfugios de mililitros. Pellet las células centrifugando a 9, 600 veces G durante dos minutos.
Deseche el sobrenadante y lave el pellet dos veces en un mililitro de 1X PBS canalizando hacia arriba y hacia abajo. Resuspend el pellet final en 1, 200 microlitros de 1X PBS. Mezcle bien y extienda 100 microlitros de la mezcla celular en placas grandes de agar KB suplementadas con kanamicina e incube a 30 grados centígrados durante la noche.
Contar el número total de colonias transconjugantes en las tres placas y extrapolar para calcular el número aproximado de mutantes obtenidos en todas las placas. Para aumentar las posibilidades de obtener una biblioteca representativa, asegúrese de que el número total de colonias sea varias veces mayor que el número total de genes en el genoma. Para confirmar el éxito de la conjugación, realice una PCR dirigida al casete de inserción utilizando de 10 a 20 colonias de muestra como se describe en el manuscrito.
Bajo una capucha estéril, raspe las colonias de las placas agregando de uno a dos mililitros de 1X PBS en el agar. Agrupa la mezcla celular raspada de las placas en tubos de 50 mililitros. Vórtice la biblioteca para mezclar a fondo, y luego divida un mililitro de la biblioteca mutante agrupada en varios tubos crioedores.
Agregue un mililitro de glicerol al 70% a los tubos y guárdelo a menos 80 grados centígrados. Seleccione una nidada de huevos L.villosa y cuente el número de huevos que continúan si la nidada contiene más de 100 huevos. Para esterilizar toda la nidada de huevos, agregue 200 microlitros de etanol al 70% y lave suavemente los huevos durante cinco minutos, luego retire el etanol y lave los huevos dos veces con agua en autoclave.
Añadir 200 microlitros de lejía al 12% y lavar suavemente los huevos durante 30 segundos. Retire la lejía inmediatamente y lave los huevos de nuevo tres veces con 200 microlitros de agua en autoclave. Infecte los huevos en la nidada de huevos esterilizados usando dos veces 10 a las seis células por microlitro de la biblioteca de mutantes lavados en PBS.
Dos días después de que eclosionen las larvas de escarabajo infectado, recolecte larvas de instar de 100 segundos por tubo de microfugio de 1.5 mililitros y guárdelo a menos 80 grados centígrados. Para generar la biblioteca de control in vitro, inocular 250 microlitros de dos veces 10 a las seis células por microlitro de la biblioteca mutante en 10 mililitros de medio KB que contenga kanamicina. Después de extraer el ADN de las bibliotecas mutantes cultivadas in vivo e in vitro, comparta el ADN con un ultrasonido.
Para verificar si el ADN se cortó al rango de tamaño deseado, cargue cinco microlitros del ADN sin escuchar y esquilar después de mezclarlo con el tinte de carga de gel en una proporción de uno a uno en un gel de agarosa al 1.6% a 250 voltios durante 40 minutos. Para preparar los extremos del fragmento necesarios para la ligadura del adaptador, comience agregando tres microlitros de la mezcla de enzimas y siete microlitros de tampón de reacción a 50 microlitros del ADN cortado y mezcle bien mediante pipeteo. Ajuste un termociclador con una tapa calentada a más o igual a 75 grados centígrados e incube las muestras durante 30 minutos a 20 grados centígrados y 30 minutos a 65 grados centígrados, luego mantenga la temperatura a cuatro grados centígrados.
Para la ligadura del adaptador, agregue 30 microlitros de mezcla maestra de ligadura, un microlitro de potenciador de ligadura y 2.5 microlitros de adaptador diluido a los productos de la etapa de preparación final. Mezclar bien mediante pipeteo e incubar la muestra durante 15 minutos a 20 grados centígrados en el termociclador con la tapa calentada apagada. Después de 15 minutos, agregue tres microlitros de la enzima.
Mezclar bien mediante pipeteo e incubar la muestra durante 15 minutos a 37 grados centígrados en un termociclador con la tapa calentada a más o igual a 47 grados centígrados. Para seleccionar el tamaño del ADN ligado del adaptador dirigido a fragmentos de 250 pares de bases, comience por vórtice la solución de perla magnética y colóquela a temperatura ambiente durante 30 minutos antes de su uso. Agregue 0.3 veces de cuentas a 96.5 microlitros de la mezcla de ADN ligado y mezcle pipeteando a fondo.
Incubar la mezcla de cuentas durante cinco minutos. Coloque los tubos en un soporte magnético para tirar de las cuentas y eliminar fragmentos de ADN de tamaño no deseado. Deje que las perlas se asienten durante cinco minutos y luego transfiera el sobrenadante transparente a un nuevo tubo de microfuge.
Agregue 0.15 veces de cuentas frescas al sobrenadante y mezcle pipeteando bien. Incubar la mezcla de perlas durante cinco minutos y luego colocar los tubos en un soporte magnético para tirar de las perlas unidas al ADN objetivo. Espere cinco minutos y luego deseche el sobrenadante, manteniendo las cuentas.
Con las perlas en el soporte magnético, agregue 200 microlitros de etanol 80% recién preparado y espere 30 segundos antes de desechar el etanol sin molestar las perlas. Retire los tubos del soporte y agregue 17 microlitros de 0.1X TE o Low TE, luego mezcle 10 veces mediante pipeteo e incube la mezcla a temperatura ambiente durante dos minutos. Coloque el tubo en el soporte magnético y tome 15 microlitros del ADN seleccionado para PCR-1.
Perlas de estreptavidina vórtice y colóquelas a temperatura ambiente durante al menos 30 minutos. Tome 32 microlitros de las cuentas y lávelas con 500 microlitros de 1X bind y wash buffer. Agregue 32 microlitros de 2X bind y lave el tampón y resuspenda las perlas.
A esto, agregue 32 microlitros de los productos PCR-1 limpios. Mezclar bien e incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos. Coloque la mezcla de ADN de perlas en un soporte magnético durante dos minutos.
Pipetee el sobrenadante ya que el ADN marcado con biotina que contiene el borde de inserción se une a la estreptavidina en las perlas. Lave las cuentas con 500 microlitros de 1X bind y wash buffer, y luego lave las cuentas con 200 microlitros de Low TE. Resuspend las perlas unidas al ADN en 17 microlitros de TE Baja. El ADN de las bibliotecas mutantes cultivadas in vivo e in vitro extraídas y fragmentadas en un ultrasonido mostró que la mayoría de los fragmentos abarcan entre 100 y 400 pares de bases. La ubicación de las inserciones mediadas por transposones a través de los cuatro replicones del genoma de la cepa A de Burkholderia gladioli se puede observar en la vaina.
En la tabla se puede observar un resumen de la salida de secuenciación y el número de inserciones únicas y genes alcanzados en las tres bibliotecas replicadas in vivo e in vitro. Lo importante a recordar es calcular el tamaño del cuello de botella de la población durante la colonización del huésped para obtener una representación adecuada de la biblioteca durante la infección. Además, ajuste para un número compatible de generaciones bacterianas in vitro y en el huésped.
Después de generar la biblioteca de mutantes de transposones, se puede filtrar en medios selectivos para recuperar mutantes en función de las diferencias fenotípicas. Por lo tanto, se pueden identificar genes específicos importantes para una afección.
