Bu protokol simbiyotik bakteriler üzerinde, bu durumda, özellikle Burkholderia üzerinde genetik manipülasyon yapmak ve bir böcek konağını kolonileştirmek için gerekli genleri tanımlamak için yararlıdır. Transposon ekleme dizilimi, tek bir deneyde aynı anda çok sayıda koşullu temel geni tanımlamak için güçlü bir araçtır. Steril bir başlık altında Kanamycin ve DAP ile desteklenmiş 10 mililitre LB ortamında E.coli donörün taze donör kültürünü aşılayarak başlayın.
Inoculate Burkholderia gladioli suş Beş mililitre KB ortamında bir alıcı hücreleri. Kültürleri 250 RPM'de bir çalkalayıcıda bir gecede 30 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Bir gecede büyümeden sonra, hücreleri peletmek ve süpernatantı atmak için altı dakika boyunca her bir kültürün dört mililitresini 9.600 kez G'de santrifüjleyin.
Steril bir kaputun altında, peletlenmiş hücre kültürlerini DAP içeren KB ortamında yıkayın. Ve son olarak, kültürleri dört mililitre KB artı DAP ortamında ayrı ayrı yeniden dirildirin. Taze 15 mililitrelik bir tüpte, yıkanmış E.coli donör hücrelerinin 250 mikrolitresini yıkanmış Burkholderia gladioli suşu A alıcı hücrelerinin bir mililitresi ile karıştırın.
Bu konjugasyon hücresi karışımının 10 mikrolitresini DAP içeren KB agar plakalarında tespit edin. Plakanın steril kaputta bir saat boyunca oda sıcaklığında bozulmadan dinlenmesine izin verin. Plakaları 30 santigrat derecede konjugasyon noktalarıyla 12 ila 18 saat boyunca kuluçkaya yatırın.
Kuluçkadan sonra, steril bir kaputun altındaki plakalara iki ila dört mililitre 1X PBS ekleyin ve büyüyen bakteriyel konjugasyon noktalarını agardan serbest bırakmak için bir hücre kazıyıcı kullanın. Daha sonra konjuge hücre karışımını iki mililitre mikroyakıt tüpüne pipetle ekleyin. hücreleri iki dakika boyunca 9.600 kez G'de santrifüjleyarak peletleyin.
Süpernatantı atın ve peleti yukarı ve aşağı borulayarak 1X PBS'nin bir mililitresinde iki kez yıkayın. Son peleti 1X PBS'nin 1.200 mikrolitresinde yeniden sunun. İyice karıştırın ve kanamycin ile desteklenmiş büyük KB agar plakalarına 100 mikrolitre hücre karışımını yayın ve bir gecede 30 santigrat derecede kuluçkaya yayın.
Üç plakadaki transkonjugant kolonilerinin toplam sayısını sayın ve tüm plakalarda elde edilen yaklaşık mutant sayısını hesaplamak için tahminde bulunma. Temsili bir kütüphane elde etme şansını artırmak için, toplam koloni sayısının genomdaki toplam gen sayısından birkaç kat daha fazla olduğundan emin olun. Konjugasyonun başarısını doğrulamak için, yazıda açıklandığı gibi 10 ila 20 örnek koloni kullanarak ekleme kasetini hedefleyen bir PCR gerçekleştirin.
Steril bir kaputun altında, ağar üzerine bir ila iki mililitre 1X PBS ekleyerek kolonileri plakalardan kazıyın. Plakalardan kazınmış hücre karışımını 50 mililitrelik tüplere bir araya koyun. Kütüphaneyi iyice karıştırmak için girdaplayın ve sonra havuza alınmış mutant kütüphanesinin bir mililitresini birkaç kriyo tüpüne bölün.
Tüplere bir mililitre% 70 gliserol ekleyin ve eksi 80 santigrat derecede saklayın. Bir L.villosa yumurta debriyajı seçin ve debriyaj 100'den fazla yumurta içeriyorsa devam eden yumurta sayısını sayın. Tüm yumurta debriyajını sterilize etmek için, % 70 etanol 200 mikrolitre ekleyin ve yumurtaları beş dakika hafifçe yıkayın, ardından etanolleri çıkarın ve yumurtaları iki kez otomatik kapatılmış suyla yıkayın.
200 mikrolitre % 12 çamaşır suyu ekleyin ve yumurtaları 30 saniye boyunca hafifçe yıkayın. Çamaşır suyunu hemen çıkarın ve yumurtaları 200 mikrolitre otoklavlı su ile üç kez tekrar yıkayın. PBS'deki yıkanmış mutant kütüphanesinin mikroliter başına altı hücreye iki kez 10 kez kullanarak sterilize edilmiş yumurta debriyajındaki yumurtaları enfekte edin.
Enfekte böcek larvaları yumurtadan çıktıktan iki gün sonra, 1,5 mililitre mikrofuge tüpü başına 100 saniye instar larva toplayın ve eksi 80 santigrat derecede depolayın. İn vitro kontrol kütüphanesini oluşturmak için, kanamycin içeren 10 mililitre KB ortamda mutant kütüphanesinin mikrolitresi başına altı hücreye iki çarpı 10'luk 250 mikrolitre aşılayın. In vivo ve in vitro büyümüş mutant kütüphanelerinden DNA çıkardıktan sonra, DNA'yı bir ultrasonicator ile paylaşın.
DNA'nın istenen boyut aralığına yamuğuna yayılıp yatıştırılmadığını kontrol etmek için, 40 dakika boyunca 250 voltta çalışan%1,6 agarose jelin üzerinde bire bir oranında jel yükleme boyası ile karıştırıldıktan sonra duyulmamış ve yamtulan DNA'nın beş mikrolitresini yükleyin. Adaptör ligasyonu için gerekli parça uçlarını hazırlamak için, 50 mikrolitrelik parçalanmış DNA'ya enzim karışımının üç mikrolitresini ve yedi mikrolitre reaksiyon tamponunu ekleyerek başlayın ve pipetleme ile iyice karıştırın. Isıtılmış kapağı 75 santigrat dereceden büyük veya eşit olan bir termosikler ayarlayın ve numuneleri 20 santigrat derecede 30 dakika ve 65 santigrat derecede 30 dakika kuluçkaya bırakın, ardından sıcaklığı dört santigrat derecede tutun.
Adaptör ligasyonu için, son hazırlık adımının ürünlerine 30 mikrolitre ligasyon ana karışımı, bir mikrolitre ligasyon arttırıcı ve 2,5 mikrolitre seyreltilmiş adaptör ekleyin. Pipetleme ile iyice karıştırın ve numuneyi ısıtılmış kapak kapalıyken termosikler içinde 20 santigrat derecede 15 dakika kuluçkaya yatırın. 15 dakika sonra enzimin üç mikrolitresini ekleyin.
Pipetleme yaparak iyice karıştırın ve numuneyi 47 santigrat dereceden büyük veya eşit derecede ısıtılmış bir termosikler içinde 37 santigrat derecede 15 dakika kuluçkaya yatırın. 250 baz çiftinden oluşan adaptör ligli DNA hedefleme parçalarının boyutunu seçmek için manyetik boncuk çözeltisini girdaplayarak başlayın ve kullanmadan önce 30 dakika boyunca oda sıcaklığına yerleştirin. Liglenmiş DNA karışımının 96,5 mikrolitresine 0,3 kez boncuk ekleyin ve iyice pipetleyarak karıştırın.
Boncuk karışımını beş dakika kuluçkaya yatırın. Boncukları aşağı çekmek ve istenmeyen boyuttaki DNA parçalarını çıkarmak için tüpleri manyetik bir standa yerleştirin. Boncukların beş dakika yerleşmesine izin verin ve ardından berrak süpernatantı yeni bir mikroyapı tüpüne aktarın.
Süpernatant içine 0,15 kat taze boncuk ekleyin ve iyice pipetleme yaparak karıştırın. Boncuk karışımını beş dakika kuluçkaya yatırın ve ardından hedef DNA'ya bağlı boncukları aşağı çekmek için tüpleri manyetik bir standa yerleştirin. Beş dakika bekleyin ve sonra boncukları tutarak üstnatant atın.
Manyetik standdaki boncuklarla, 200 mikrolitre taze hazırlanmış% 80 etanol ekleyin ve boncukları bozmadan etanol atmadan önce 30 saniye bekleyin. Tüpleri standdan çıkarın ve 0,1X TE veya Düşük TE'nin 17 mikrolitresini ekleyin, ardından 10 kez pipetleyarak karıştırın ve karışımı oda sıcaklığında iki dakika kuluçkaya bırakın. Tüpü manyetik standa yerleştirin ve PCR-1 için boyut tarafından seçilen DNA'nın 15 mikrolitresini alın.
Vortex streptavidin boncukları ve en az 30 dakika oda sıcaklığında yerleştirin. Boncuklardan 32 mikrolitre alın ve 500 mikrolitre 1X bağlama ile yıkayın ve tamponu yıkayın. 32 mikrolitre 2X bağlama ekleyin ve tamponu yıkayın ve boncukları yeniden depoleyin.
Buna, temizlenmiş PCR-1 ürünlerinden 32 mikrolitre ekleyin. İyice karıştırın ve oda sıcaklığında 30 dakika kuluçkaya yatır. Boncuk DNA karışımını iki dakika boyunca manyetik bir standa yerleştirin.
Pipet, takma kenarını içeren biotin etiketli DNA olarak süpernatantı boncuklardaki streptavidin'e bağlar. Boncukları 500 mikrolitre 1X bağlama ve yıkama tamponu ile yıkayın ve ardından boncukları 200 mikrolitre Düşük TE ile yıkayın. DNA'ya bağlı boncukları 17 mikrolitre Düşük TE'de yeniden dirilt. Bir ultrasonicator ayıklanmış ve parçalanmış in vivo ve in vitro büyümüş mutant kütüphanelerinin DNA'sı, parçaların çoğunun 100 ila 400 baz çifti arasında yayıldığını gösterdi. Burkholderia gladioli suşu A genomunun dört replikononu boyunca transposon aracılı eklemelerin yeri podda görülebilir.
Sıralama çıktısının bir özeti ve üç kopya in vivo ve in vitro kütüphanede isabet eden benzersiz ekleme ve genlerin sayısı tabloda gözlemlenebilir. Hatırlanması gereken önemli şey, enfeksiyon sırasında kütüphanenin uygun bir temsilini elde etmek için konak kolonizasyonu sırasında nüfus darboğaz boyutunu hesaplamaktır. Ayrıca, in vitro ve konakta uyumlu sayıda bakteriyel nesil için ayarlayın.
Transposon mutant kütüphanesi oluşturulduktan sonra, fenotipik farklılıklara dayanarak mutantları kurtarmak için seçici medyada taranabilir. Böylece bir durum için önemli olan spesifik genler tanımlanabilir.
