Questo protocollo è utile per eseguire manipolazioni genetiche su batteri simbiotici, in questo caso, in particolare su Burkholderia, e identificare i geni essenziali per colonizzare un ospite insetto. Il sequenziamento dell'inserzione di trasposone è un potente strumento per identificare un gran numero di geni condizionalmente essenziali contemporaneamente in un singolo esperimento. Inizia inoculando una coltura di donatore fresco di donatore di E.coli in 10 millilitri di mezzo LB integrato con Kanamicina e DAP sotto un cappuccio sterile.
Cellule riceventi di Burkholderia gladioli inoculato ceppo A in cinque millilitri di terreno KB. Incubare le colture a 30 gradi Celsius durante la notte su uno shaker a 250 RPM. Dopo la crescita durante la notte, centrifugare quattro millilitri di ciascuna delle colture a 9.600 volte G per sei minuti per pellettare le cellule e scartare il surnatante.
Sotto un cappuccio sterile, lavare le colture cellulari pellettate in un mezzo KB contenente DAP. E infine, risuscindi le colture separatamente in quattro millilitri di KB più il mezzo DAP. In un tubo fresco da 15 millilitri, mescolare 250 microlitri delle cellule donatrici di E.coli lavate con un millilitro delle cellule riceventi del ceppo A di Burkholderia gladioli lavate.
Spot 10 microlitri di questa miscela di celle di coniugazione su piastre di agar KB contenenti DAP. Lasciare riposare indisturbato la piastra nel cappuccio sterile a temperatura ambiente per un'ora. Incubare le piastre con i punti di coniugazione a 30 gradi Celsius per 12-18 ore.
Dopo l'incubazione, aggiungere da due a quattro millilitri di 1X PBS sulle piastre sotto un cappuccio sterile e utilizzare un raschietto cellulare per rilasciare i punti di coniugazione batterica cresciuti dall'agar. Quindi pipettare la miscela di cellule coniugate in due tubi di microfugazione millilitro. Pellet le celle centrifugando a 9.600 volte G per due minuti.
Scartare il surnatante e lavare il pellet due volte in un millilitro di 1X PBS tubando su e giù. Ripresa del pellet finale in 1.200 microlitri di 1X PBS. Mescolare bene e distribuire 100 microlitri della miscela cellulare su grandi piastre di agar KB integrate con Kanamicina e incubare a 30 gradi Celsius durante la notte.
Contare il numero totale di colonie transconigiunte sulle tre piastre ed estrapolare per calcolare il numero approssimativo di mutanti ottenuti in tutte le piastre. Per aumentare le possibilità di ottenere una libreria rappresentativa, assicurarsi che il numero totale di colonie sia diverse volte superiore al numero totale di geni nel genoma. Per confermare il successo della coniugazione, eseguire una PCR mirata alla cassetta di inserimento utilizzando da 10 a 20 colonie di campioni come descritto nel manoscritto.
Sotto un cappuccio sterile, raschiare le colonie dalle piastre aggiungendo uno o due millilitri di 1X PBS sull'agar. Mettere a piscina la miscela cellulare raschiata via dalle piastre in tubi da 50 millilitro. Vortex la libreria per mescolare accuratamente, e poi dividere un millilitro della libreria mutante raggruppata in diversi tubi crio.
Aggiungere un millilitro di glicerolo al 70% ai tubi e conservare a meno 80 gradi Celsius. Selezionare una frizione di uova L.villosa e contare il numero di uova che continuano se la frizione contiene più di 100 uova. Per sterilizzare l'intera frizione delle uova, aggiungere 200 microlitri di etanolo al 70% e lavare delicatamente le uova per cinque minuti, quindi rimuovere l'etanolo e lavare le uova due volte con acqua autoclavata.
Aggiungere 200 microlitri di candeggina al 12% e lavare delicatamente le uova per 30 secondi. Rimuovere immediatamente la candeggina e lavare nuovamente le uova tre volte con 200 microlitri di acqua autoclavata. Infettare le uova nella frizione di uova sterilizzate usando due volte 10 alle sei cellule per microlitro della libreria mutante lavata in PBS.
Due giorni dopo che le larve di coleottero infetto si schiudono, raccogliere larve di 100 secondi per tubo di microfuga da 1,5 millilitro e conservare a meno 80 gradi Celsius. Per generare la libreria di controllo in vitro, inoculare 250 microlitri di due volte 10 alle sei cellule per microlitro della libreria mutante in 10 millilitri di terreno KB contenente Kanamicina. Dopo aver estratto il DNA dalle librerie mutanti cresciute in vivo e in vitro, condividi il DNA con un ultrasuoni.
Per verificare se il DNA è stato tranciato nell'intervallo di dimensioni desiderato, caricare cinque microlitri del DNA non scuoiato e tranciato dopo la miscelazione con colorante di carico del gel in un rapporto uno a uno su un gel di agarose all'1,6% a 250 volt per 40 minuti. Per preparare le estremità del frammento necessarie per la legatura dell'adattatore, iniziare aggiungendo tre microlitri della miscela enzimatica e sette microlitri di tampone di reazione a 50 microlitri del DNA tranciato e mescolare bene mediante pipettaggio. Impostare un termociclatore con un coperchio riscaldato a maggiore o uguale a 75 gradi Celsius e incubare i campioni per 30 minuti a 20 gradi Celsius e 30 minuti a 65 gradi Celsius, quindi mantenere la temperatura a quattro gradi Celsius.
Per la legatura dell'adattatore, aggiungere 30 microlitri di miscela principale di legatura, un microlitro di potenziatore di legatura e 2,5 microlitri di adattatore diluito ai prodotti della fase di preparazione finale. Mescolare accuratamente mediante pipettaggio e incubare il campione per 15 minuti a 20 gradi Celsius nel termociclatore con il coperchio riscaldato spento. Dopo 15 minuti, aggiungere tre microlitri dell'enzima.
Mescolare bene pipettando e incubare il campione per 15 minuti a 37 gradi Celsius in un termociclatore con il coperchio riscaldato a più o uguale a 47 gradi Celsius. Per selezionare la dimensione del DNA legato all'adattatore che prende di mira frammenti di 250 coppie di basi, iniziare vorticosamente la soluzione di perle magnetiche e posizionarla a temperatura ambiente per 30 minuti prima dell'uso. Aggiungere 0,3 volte di perle a 96,5 microlitri della miscela di DNA legato e mescolare pipettando accuratamente.
Incubare la miscela di perle per cinque minuti. Posizionare i tubi su un supporto magnetico per tirare giù le perle e rimuovere frammenti di DNA di dimensioni indesiderate. Lasciare che le perle si depositino per cinque minuti e poi trasferire il surnatante trasparente in un nuovo tubo di microfuga.
Aggiungere 0,15 volte di perle fresche al surnatante e mescolare pipettando bene. Incubare la miscela di perle per cinque minuti e quindi posizionare i tubi su un supporto magnetico per tirare giù le perle legate al DNA bersaglio. Attendere cinque minuti e poi scartare il surnatante, mantenendo le pere.
Con le perle sul supporto magnetico, aggiungere 200 microlitri di etanolo all'80% appena preparato e attendere 30 secondi prima di scartare l'etanolo senza disturbare le perle. Rimuovere i tubi dal supporto e aggiungere 17 microlitri di 0,1X TE o Low TE, quindi mescolare per pipettaggio 10 volte e incubare la miscela a temperatura ambiente per due minuti. Posizionare il tubo sul supporto magnetico e prendere 15 microlitri del DNA selezionato per PCR-1.
Perle di streptavitina Vortex e metterle a temperatura ambiente per almeno 30 minuti. Prendi 32 microlitri delle perle e lavali con 500 microlitri di tampone 1X bind e wash. Aggiungere 32 microlitri di 2X legare e lavare il tampone e risospenare le perle.
A questo, aggiungere 32 microlitri dei prodotti PCR-1 ripuliti. Mescolare accuratamente e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti. Posizionare la miscela di DNA di perle su un supporto magnetico per due minuti.
Pipettare il surnatante come DNA etichettato con biotina contenente il bordo di inserzione si lega alla streptavitina sulle perle. Lavare le perle con 500 microlitri di 1X bind e wash buffer, quindi lavare le perle con 200 microlitri di Low TE. Sospendare le perle legate al DNA in 17 microlitri di LOW TE. Il DNA delle librerie mutanti in vivo e in vitro estratte e frammentate in un ultrasuoni ha mostrato che la maggior parte dei frammenti si estende tra 100 e 400 coppie di basi. La posizione delle inserzioni mediate dal trasposone attraverso i quattro repliconi del genoma del ceppo A di Burkholderia gladioli può essere osservata nel baccello.
Un riepilogo dell'output del sequenziamento e del numero di inserzioni uniche e geni colpiti nelle tre librerie replicate in vivo e in vitro può essere osservato nella tabella. La cosa importante da ricordare è calcolare la dimensione del collo di bottiglia della popolazione durante la colonizzazione dell'ospite per ottenere una rappresentazione appropriata della biblioteca durante l'infezione. Inoltre, regolare per un numero compatibile di generazioni batteriche in vitro e nell'ospite.
Dopo aver generato la libreria mutante di trasposoni, può essere sottoposta a screening su supporti selettivi per recuperare i mutanti in base alle differenze fenotipiche. È quindi possibile identificare geni specifici importanti per una condizione.
