Este protocolo é útil para realizar manipulação genética em bactérias simbióticas, neste caso, especificamente na Burkholderia, e identificar os genes essenciais para colonizar um hospedeiro de insetos. O sequenciamento da inserção transposon é uma ferramenta poderosa para identificar um grande número de genes condicionalmente essenciais simultaneamente em um único experimento. Comece inoculando uma nova cultura de doadores de doadores de E.coli em 10 mililitros de meio LB suplementados com Kanamycin e DAP sob um capô estéril.
Inoculada Burkholderia gladioli strain A células receptoras em cinco mililitros de meio KB. Incubar as culturas a 30 graus Celsius durante a noite em um shaker a 250 RPM. Após o crescimento da noite para o dia, centrífugas quatro mililitros de cada uma das culturas a 9.600 vezes G por seis minutos para pelotar as células e descartar o sobrenante.
Sob um capô estéril, lave as culturas celulares pelleted em meio KB contendo DAP. E, finalmente, resuspense as culturas separadamente em quatro mililitros de KB mais meio DAP. Em um tubo fresco de 15 mililitros, misture 250 microliters das células doadoras E.coli lavadas com um mililitro da cepa de gladioli burkholderia lavada A células receptoras.
Local 10 microliters desta mistura de célula de conjugação em placas de ágar KB contendo DAP. Deixe a placa descansar sem ser perturbada no capô estéril à temperatura ambiente por uma hora. Incubar as placas com os pontos de conjugação a 30 graus Celsius durante 12 a 18 horas.
Após a incubação, adicione dois a quatro mililitros de 1X PBS nas placas sob um capô estéril e use um raspador de células para liberar os pontos de conjugação bacteriana cultivados do ágar. Em seguida, pipeta a célula conjugada mistura em dois tubos de microfuça mililitro. Pellet as células por centrifugação a 9.600 vezes G por dois minutos.
Descarte o supernatante e lave a pelota duas vezes em um mililitro de 1X PBS, pipetando para cima e para baixo. Resuspense a última pelota em 1.200 microliters de 1X PBS. Misture bem e espalhe 100 microliters da mistura celular em grandes placas de ágar KB suplementadas com Kanamycin e incubar a 30 graus Celsius durante a noite.
Conte o número total de colônias transconjugut nas três placas e extrapolule para calcular o número aproximado de mutantes obtidos em todas as placas. Para aumentar as chances de obter uma biblioteca representativa, certifique-se de que o número total de colônias seja várias vezes maior do que o número total de genes no genoma. Para confirmar o sucesso da conjugação, realize um PCR visando o de inserção usando 10 a 20 colônias de amostras como descrito no manuscrito.
Sob um capô estéril, raspe as colônias das placas adicionando um a dois mililitros de 1X PBS no ágar. Misture a mistura celular raspada das placas em tubos de 50 mililitros. Vórtice a biblioteca para misturar completamente, e, em seguida, dividir um mililitro da biblioteca mutante agrupada em vários tubos criogênicos.
Adicione um mililitro de 70% de glicerol aos tubos e armazene a menos 80 graus Celsius. Selecione uma embreagem de ovo L.villosa e conte o número de ovos continuando se a embreagem contiver mais de 100 ovos. Para esterilizar toda a embreagem do ovo, adicione 200 microlitadores de 70% de etanol e lave suavemente os ovos por cinco minutos, depois retire o etanol e lave os ovos duas vezes com água autoclavada.
Adicione 200 microliters de 12% de alvejante e lave delicadamente os ovos por 30 segundos. Remova o alvejante imediatamente e lave os ovos novamente três vezes com 200 microliters de água autoclavada. Infecte os ovos na embreagem de ovos esterilizados usando duas vezes 10 para as seis células por microliter da biblioteca mutante lavada na PBS.
Dois dias após a escotilha de larvas de besouro infectado, colete 100 larvas instar por tubo de microfuge de 1,5 mililitro e armazene a menos 80 graus Celsius. Para gerar a biblioteca de controle in vitro, inocular 250 microliters de duas vezes 10 para as seis células por microliter da biblioteca mutante em 10 mililitros de KB médio contendo Kanamicina. Depois de extrair DNA das bibliotecas mutantes in vivo e in vitro, compartilhe o DNA com um ultrassonador.
Para verificar se o DNA foi cortado para a faixa de tamanho desejada, carregue cinco microliters do DNA descomproxido e cortado depois de misturar com corante de carregamento de gel em uma proporção de um para um em um gel de 1,6% agarose executado a 250 volts por 40 minutos. Para preparar as extremidades do fragmento necessárias para a ligadura do adaptador, comece adicionando três microliters da mistura de enzimas e sete microliters de tampão de reação a 50 microliters do DNA cortado e misture bem por pipetação. Coloque um termociclador com uma tampa aquecida maior ou igual a 75 graus Celsius e incubar as amostras por 30 minutos a 20 graus Celsius e 30 minutos a 65 graus Celsius, depois mantenha a temperatura em quatro graus Celsius.
Para ligadura adaptador, adicione 30 microliters de mistura master de ligadura, um microliter de ligadura e 2,5 microlitres de adaptador diluído aos produtos da etapa final de preparação. Misture bem por pipetar e incubar a amostra por 15 minutos a 20 graus Celsius no termociclador com a tampa aquecida desligada. Após 15 minutos, adicione três microliters da enzima.
Misture bem por pipetar e incubar a amostra por 15 minutos a 37 graus Celsius em um termociclador com a tampa aquecida a mais ou igual a 47 graus Celsius. Para selecionar o tamanho do adaptador ligado DNA visando fragmentos de 250 pares de base, comece por vórtice da solução de contas magnéticas e coloque-a em temperatura ambiente por 30 minutos antes do uso. Adicione 0,3 vezes de contas a 96,5 microliters da mistura de DNA ligada e misture completamente por pipeta.
Incubar a mistura de contas por cinco minutos. Coloque os tubos em um suporte magnético para puxar as contas e remover fragmentos de DNA de tamanho indesejado. Deixe as contas se contentarem por cinco minutos e depois transfira o supernatante claro para um novo tubo de microfuça.
Adicione 0,15 vezes de contas frescas ao supernatante e misture bem a pipetar bem. Incubar a mistura de contas por cinco minutos e, em seguida, colocar os tubos em um suporte magnético para puxar para baixo as contas ligadas ao DNA alvo. Espere por cinco minutos e depois descarte o supernatante, mantendo as contas.
Com as contas no suporte magnético, adicione 200 microliters de 80% de etanol recém-preparado e espere 30 segundos antes de descartar o etanol sem perturbar as contas. Retire os tubos do suporte e adicione 17 microliters de 0,1X TE ou Low TE, depois misture por pipetar 10 vezes e incubar a mistura em temperatura ambiente por dois minutos. Coloque o tubo no suporte magnético e pegue 15 microliters do DNA selecionado para PCR-1.
Vórtice streptavidin contas e colocá-los em temperatura ambiente por pelo menos 30 minutos. Pegue 32 microliters das contas e lave-as com 500 microliters de 1X bind and wash buffer. Adicione 32 microliters de 2X ligue e lave o buffer e resuspende as contas.
Para isso, adicione 32 microliters dos produtos PCR-1 limpos. Misture bem e incubar à temperatura ambiente por 30 minutos. Coloque a mistura de DNA de contas em um suporte magnético por dois minutos.
Pipeta fora do supernante como DNA marcado por biotina contendo a borda de inserção liga-se ao streptavidin nas contas. Lave as contas com 500 microliters de 1X ligue e lave o tampão e depois lave as contas com 200 microliters de Low TE. Resuspend as contas ligadas ao DNA em 17 microliters de Low TE. O DNA das bibliotecas mutantes in vivo e in vitro cultivadas extraídas e fragmentadas em um ultrassonônico mostrou que a maioria dos fragmentos abrange entre 100 e 400 pares de bases. A localização de inserções mediadas por transposon através dos quatro replicons da cepa de gladioli burkholderia A pode ser observada na cápsula.
Um resumo da saída de sequenciamento e o número de inserções e genes únicos atingidos nas três bibliotecas involum e in vitro podem ser observados na tabela. O importante a lembrar é calcular o tamanho do gargalo populacional durante a colonização do hospedeiro para obter uma representação adequada da biblioteca durante a infecção. Além disso, ajuste para um número compatível de gerações bacterianas in vitro e no hospedeiro.
Depois de gerar a biblioteca mutante transposon, ela pode ser exibida em mídia seletiva para recuperar mutantes com base em diferenças fenotípicas. Genes específicos importantes para uma condição podem, assim, ser identificados.
