الهدف العام لهذا الإجراء هو إظهار طرق تشريح الساق الكبار من Drosophila. تزيل هذه التقنية جزءا من الشرج ، مما يعرض الأنسجة الأساسية بطريقة تحافظ على بنية الخلايا العصبية والعضلات. يسمح لنا هذا الإجراء بتوصيف التقاطع العصبي العضلي ل أربور الخلايا العصبية الحركية المحددة ، باستخدام التقنيات الكيميائية المناعية القياسية.
تشريح مفيد بشكل خاص لدراسة التغيرات التنكسية البطيئة التي تحدث على مدى فترات طويلة نسبيا من الزمن. الجانب الزمني هو اعتبار مهم ، لأن التقاطع العصبي العضلي المميز ليرقات Drosophila مستقر لمدة خمسة إلى سبعة أيام تقريبا قبل ظهور التحول. على العكس من ذلك ، فإن الخلايا العصبية البالغة موجودة طوال حياة ذبابة الكبار ، ما يقرب من 90 يوما لDrosophila melanogaster البرية من النوع ، التي تربى في المختبر.
هذه التقنية مرنة ويمكن تطبيقها على مجموعة من الأنماط الجينية لنماذج الأمراض المختلفة ، والاستفادة من مجموعة من الأجسام المضادة المتاحة ل Drosophila كنظام نموذجي. الهدف العام لهذا الإجراء هو إظهار طرق تشريح الساق الكبار من Drosophila. هذه التقنية يزيل جزءا من كتل، وفضح الأنسجة الكامنة في الطريقة التي تحافظ على الهندسة العصبية والعضلات.
باستخدام فرشاة الطلاء، نقل الذباب إلى الميثانول البارد في بئر زجاجي أو طبق لمدة 30 ثانية تقريبا إلى دقيقة واحدة. يقوم الميثانول بتشحيم الهيدروكربونات القطعية، ويمكن الآن غمر الذباب بدلا من تعويمه في المحاليل المائية. مع ملقط، نقل الذباب بعناية إلى برنامج تلفزيوني.
شطف ثلاث مرات في الجليد البارد PBS لإزالة الميثانول الزائد، والحفاظ على الذباب في برنامج تلفزيوني على الجليد حتى تشريح والتثبيت. عند هذه النقطة ، يجب تشريح الذباب وإصلاحه في أقصر وقت ممكن ، ويفضل أن يكون أقل من 30 دقيقة. نقل الذباب إلى طبق تشريح الاستومر السيليكون مليئة برنامج تلفزيوني الباردة.
إزالة الساقين metathoracic في كوكسا باستخدام اثنين من أزواج من ملقط دومون رقم خمسة، أو قطع الساقين مع مقص فاناس. نقل الساقين إلى بئر في البلاستيك، 24 لوحة بئر مليئة ميل واحد من برنامج تلفزيوني، والحفاظ على لوحة على الجليد حتى تتم إزالة جميع الساقين ونقلها إلى الآبار. نحن عادة استخدام 20 الساقين في البئر.
استبدل حل PBS بحل واحد من المليلتر FA، وتناوب على جهاز نوتاتور لمدة 30 دقيقة. إعداد نوتاتور هو أن يتم تعيين بسرعة متوسطة. تأكد من أن الساقين مغمورتان بالكامل في المحلول خلال هذا الوقت.
لإزالة حل الاتحاد الانجليزي، يغسل في برنامج تلفزيوني واحد مليون ثلاث مرات بسرعة، تليها ثلاثة يغسل إضافية لمدة خمس دقائق لكل منهما في برنامج تلفزيوني واحد ميل. عقد الأنسجة في برنامج تلفزيوني واحد ميل على الجليد، قبل وأثناء خطوات تشريح. لتقديم لمحة موجزة عن تشريح الساق Drosophila ، يشار إلى شرائح الساق ، بما في ذلك كوكسا ، trochanter ، عظم الفخذ ، الساق ، وخمسة أجزاء من القطران.
هنا نرى وجهة نظر الأمامية للساق، المعترف بها من خلال وجود شعيرات الحسية بدلا من الجلد عارية موجودة على الجانب الخلفي. كما يشار إلى اتجاه المحور القريب البعيدة والمحور الظهري البطني. يزيل إجراء التشريح هذا قطعة صغيرة من الجلد من عظم الفخذ القريب ، بحيث يمكن دراسة أربور المحور ، الذي يعرض الظهر ، وينقح عضلة الساق.
وقد ركز عملنا السابق على أربور المشار إليها، التي تنشأ من النسب العين الأرومية العصبية المفترضة. في هذا الجزء من الإجراء، نقوم بإزالة كتيكل من الجانب الأمامي من عظم الفخذ. ملقط تشريح حاسمة للنجاح، ولقد وجدنا أن إدخال منحنى طفيف في نهاية عدد خمسة ملقط غرامة فائقة يوفر شطبة الذي يسمح للكفاح أن أمسك سطحيا، بدلا من أن تكون مطعون، والتي يمكن أن تدمر الأنسجة.
نقل الساقين إلى طبق الاستومر السيليكون في برنامج تلفزيوني لتشريح. باستخدام زوج واحد من ملقط، دبوس الجزء الساق إلى طبق الاستومر السيليكون كما هو مبين هنا على الجانب الأيمن. باستخدام ملقط أخرى عقدت الجانب شطبة أسفل، والاستيلاء على قطعة من الجلد على الطرف القاصي من عظم الفخذ وسحب في الاتجاه القريب نحو trochanter.
الحفاظ على إزالة الجلد منهجيا حتى العضلات العارية مرئية في جميع أنحاء نهاية قريبة من عظم الفخذ. مرة واحدة يتم تشريح جميع الساقين، واستبدال برنامج تلفزيوني مع حل الاتحاد الانجليزي ل postfix الساقين لمدة 30 دقيقة مع اهتزاز على نوتاتور بسرعة متوسطة. بعد ذلك، غسل العينات في برنامج تلفزيوني واحد مليون لمدة ثلاث مرات سريعة، ثم ثلاث مرات لمدة خمس دقائق لكل منهما في حل PBT.
لمنع الأنسجة، واستبدال واحد مل PBT مع حل حجب تتكون من واحد ميل 5٪ مصل الماعز العادي المخفف في PBT. حضانة تشريح الساقين لمدة أربع ساعات في درجة حرارة الغرفة، أو بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية. إزالة حل حظر واستبدال مع الأجسام المضادة الأساسية التي يتم تخفيفها في حل حظر.
هنا ، نحن نستخدم أقراص مضادة كبيرة في تخفيف واحد إلى 200. وضع لوحات مرة أخرى على شاكر واحتضان في أربع درجات بين عشية وضحاها. بعد حضانة الأجسام المضادة الأولية، اغسل الأجسام المضادة الأولية في PBT واحد لمدة ثلاث مرات لفترة وجيزة، ثم ثلاث مرات لمدة 15 دقيقة لكل منهما.
كتلة الأنسجة مرة أخرى في طاحونة واحدة 5٪ مصل الماعز العادي لمدة ساعتين على الأقل في درجة حرارة الغرفة، أو بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية. إزالة حل حجب وإضافة 300 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية المخففة الفلورسنت المناسب. بالإضافة إلى ذلك، إضافة واحدة إلى عام 2000 تخفيف phalloidin مترافقة مضان لتسمية العضلات.
لاحتضان، وختم الآبار مع مختبر ختم الشريط والغطاء. أيضا، لوحات التفاف في رقائق الألومنيوم لحماية الفلوروفوريس من الضوء. احتضان لمدة ست إلى ثماني ساعات في درجة حرارة الغرفة، أو بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية.
لإزالة الأجسام المضادة الثانوية غير المنضمة، قم بإجراء عمليات غسل باستخدام PBT بطريقة مماثلة تم وصفها سابقا عند غسل الأجسام المضادة الأولية. بعد هذه الخطوة، العينات جاهزة الآن ليتم تحميلها وصورها. ترتيب الساقين الجانب الأمامي لأعلى، وتغطي مع وسائل الإعلام تصاعد إضافية إذا لزم الأمر.
كشط بلطف زوايا زلة غطاء عبر كرة الطين. الطين الناتج سيكون بمثابة فاصل بين الشريحة وزلة الغطاء ، بحيث لا يتم سحق الأنسجة. اضغط لأسفل على زلة الغطاء حتى يتم لمس الجزء العلوي من الساقين.
ختم حواف مع طلاء الأظافر وتخزينها في أربع درجات حتى التصوير. الصورة بواسطة المجهر البؤري باستخدام معلمات التصوير الموضحة في القسم الرابع من البروتوكول المكتوب. للمساعدة في التحقق من صحة بروتوكول التشريح ، نقوم أولا بتصوير الساقين عن طريق المجهر التبايني المرحلي عند التكبير المنخفض.
هنا مثال على لوحة A من تشريح جيدة على اليسار، وتشريح سيئة على اليمين التي تعطلت ألياف العضلات. لوحة C يظهر صورة confocal من تشريح جيدة في العضلات التي لم تتعطل. في المقابل، تظهر اللوحة D ساقا تالفة أثناء التشريح، حيث تكون ألياف العضلات مفقودة، كما يشير السهم.
هنا، لطخنا الساقين المصورة مع peroxidase المضادة للجلجل للكشف عن العمليات العصبية، كما هو موضح هنا في الأخضر، وأقراص مضادة كبيرة، مما يسهل تجمع مستقبلات الغلوتامات postynaptic، كما هو مبين في الأحمر، وphalloidin لتسمية العضلات، كما هو موضح باللون الأزرق. عند التقاطها في 20X التكبير مع قناة ضوء المرسلة، فمن السهل أن نرى المنطقة تشريح. لاحظ أن الأجسام المضادة تخترق جزئيا المناطق غير المقتطعة ، ويمكن رؤيتها من خلال البشرة كما هو مبين في السهم الأبيض.
كل من الخلايا العصبية الحركية الساق جعل التوقعات النمطية عند تنشيط العضلات. يركز عملنا على الخلايا العصبية الحركية التي ت الداخلي عضلة الساق ليفاتور، كما هو موضح هنا كمنطقة محاصر وأشار إليها السهم الأبيض. في أعلى تكبير 60X مع 2X التكبير على أعلى اليمين، يمكننا أن صورة بشكل فعال boutons، هو مبين باللون الأخضر، والمحيطة DLG هو مبين باللون الأحمر.
زيادة التكبير أكثر من ذلك ، أو يخطو إلى هدف 100X ، يسمح للقياس الكمي لحجم بوتون ومورفولوجيا كما هو مبين في أسفل اليمين. باستخدام تقنية التشريح هذه جنبا إلى جنب مع الكيمياء المناعية ، وجدنا أن هناك تورم بوتون يعتمد على H في نموذج متحول sod1 من ALS ، كما هو موضح هنا في الساقين H71Y القديمة ، مقارنة بعناصر التحكم في النوع البري كما هو مبين في السهام. يتم قياس أحجام بوتون في مؤامرة سرب النحل إلى اليمين.
وجدنا كذلك انخفاضا في علامة المنطقة النشطة Bruchpilot ، الموضحة باللون الأحمر ، داخل محاور HRP الملطخة بشكل ضعيف ، الموضحة باللون الأخضر ، من المسوخ H71Y. لدراسة التنكس العصبي ، غالبا ما يتم الكشف عن مجاميع البروتين في كل مكان من قبل الأجسام المضادة FK2 ، وتظهر هنا على أنها puncta إيجابية FK2 ، في محاور عصبية وعضلات ذباب sod H71 الذي يبلغ من العمر على الجانب الأيمن ، المشار إليه بالسهام. وأخيرا، يمكن تصور الميتوكوندريا عن طريق الكيمياء المناعية باستخدام جسم مضاد ATP5a أحادي النسيلة، كما هو موضح هنا باللون الأحمر داخل عضلة الساق.
وجدنا أن الميتوكوندريا تصبح مكبرة مع التقدم في السن في المسوخ H71Y. بمجرد إتقانها ، سيسمح لك إعداد الساق التشريحي وتلطيخ الأجسام المضادة المرتبطة به بتحليل التغيرات الجزيئية عند تقاطع الأعصاب العضلية للبالغين للمتحول المفضل لديك في نقاط زمنية مختلفة.
