ويمكن تكييف هذه الطريقة بسهولة لمراقبة إشارات من البروتينات الفلورية الأخرى أو يمكن استخدامها لصورة محاور في الكبار أخرى والميزة الرئيسية لهذه التقنية تسهيل إعادة بناء ممتازة ثلاثية الأبعاد وتصور من محاور عصبية وarbors المحطة الطرفية الخاصة بهم. تبدأ بملء العدد المناسب من الآبار في لوحة زجاجية متعددة الآبار مع 70٪ الإيثانول. استخدام فرشاة لإضافة 15 إلى 20 ثاني أكسيد الكربون يصير الذباب من أي عمر أو جنس إلى كل بئر وداب بلطف الذباب في الإيثانول حتى يتم غمرها بالكامل.
بعد ما لا يزيد عن دقيقة واحدة، شطف الذباب ثلاث مرات مع 0.3٪ غير الأيونية محلول المنظفات السطحية في المالحة الفوسفات المخزنة لمدة 10 دقائق على الأقل لكل غسل. بعد الغسيل الأخير، استخدم ملقط لإزالة الرأس والبطن من كل ذبابة دون إتلاف الجزء الصدري أو الساقين واستخدام غيض من زوج من ملقط غرامة ل بلطف ولكن بحزم تطبيق الضغط على تقاطع كوكسا-ثوراكس لفصل ساق واحدة من الجزء الصدري. وضع الساقين في بئر واحدة من لوحة جديدة متعددة جيدا تحتوي على الطازجة أعدت 4٪ شبهformaldehyde على الجليد لاحتضان بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية.
من المهم دفع الساقين بلطف إلى حاجز التثبيت دون السماح لهم تعويم للحصول على الساقين ثابتة بشكل جيد. في اليوم التالي، غسل الساقين خمس مرات في 0.3٪ الطازجة غير الأيونية حل المنظفات السطحية لمدة 20 دقيقة لكل غسل. بعد الغسيل الأخير، استبدل المنظفات بمتوسط التركيب، وإبقاء الساقين في وسط التركيب لمدة 24 ساعة على الأقل.
في اليوم التالي، إضافة ما يقرب من 20 ميكروليترس من 70٪ الجلسرين بجانب نهاية المغلفة من الشريحة المجهر الزجاجي وتغطية الجلسرين مع 22 في 22 ملليمتر coverslip. المقبل، إضافة في حوالي 10 خط microliter من تصاعد المتوسطة إلى يمين غطاء وتطبيق خط 30 ميكرولتر الثانية من المتوسطة تصاعد إلى يمين خط ميكرولتر 10. باستخدام ملقط غرامة، نقل ساق واحدة من لوحة متعددة جيدا في قطرة متوسطة إلى 10 شريط ميكرولتر من تصاعد المتوسطة في اتجاه الجانب الخارجي صعودا أو هبوطا.
كرر حتى تم تركيب ستة إلى ثمانية أرجل ومحاذاة ووضع غطاء الثانية على الساقين بحيث يغطي الثاني تقع قليلا على الغطاء الأول. ثم استخدام طلاء الأظافر في كل ركن من أركان الأغطية لتأمين لهم في مكان. لتصوير الساقين، استخدم الليزر 488 نانومتر واثنين من أجهزة الكشف في وقت واحد لإعداد المسار الأول للحصول على كل من GFP وsasicle السيارات fluorescence.
حدد هدف غمر الزيت من 20 إلى 25X وحدد الدقة إلى 1024 بكسل بمقدار 1024 مع عمق 12 بت وتعيين التباعد z إلى ميكرومتر واحد. قم بتحميل الشريحة على مرحلة المجهر واستخدام نفس قوة الليزر لكل من الكاشفين، وضبط كسب الكاشف الأول للحصول على إشارة GFP الساطعة وضبط الكاشف الثاني لضمان أن بعض المناطق ذات إشارة بشرة عالية تنتج إشارة مشبعة في هذا الكاشف. ثم صورة الساقين باستخدام البلاط أو خيارات الموقف لالتقاط كامل الساق إذا تم تمديد الساق أو كبيرة جدا ليتم تصويرها في إطار واحد.
لمعالجة الصور، افتح المكدس confocal في Fiji ImageJ واستخدم المكون الإضافي "تنسيقات حيوية" لفتح أي صور ليست بتنسيق TIFF. لتقسيم القنوات، حدد الصور والألوان وقنوات الانقسام. لطرح إشارة بشرة من إشارة GFP، افتح عملية وحاسبة الصورة وحدد المكدس من كاشف واحد كصورة واحدة.
في نافذة العملية، حدد طرح وحدد المسار من جهاز الكشف اثنين كصورة اثنين بحيث سيتم الحصول على إشارة GFP الذاتية فقط. استخدام الصورة، والمكدسات، Z حماية لتوليد أقصى كثافة الإسقاط للإشارة GFP الذاتية. استخدم عناصر التحكم في نافذة التحكم في السطوع لضبط السطوع والتباين.
ثم توليد كثافة متوسطة ل بشرة، تليها الصور، اللون، و دمج القنوات لدمج كومة GFP مرة أخرى مع كومة بشرة فقط المكتسبة من كاشف اثنين. وهذا سيؤدي إلى صورة RGB تتألف من إشارة GFP الخاصة بالأنسجة بالإضافة إلى إشارة بشرة للمساعدة في تحديد أربور محور عصبي داخل أجزاء الساق. لاستخدام الماكرو، افتح المكدس confocal وانقر فوق صورة، وضبط، وسطوع/تباين.
ثم انقر فوق البرنامج المساعد وتشغيل ماكرو لتشغيل الماكرو واتبع الإرشادات. عند طلب تحديد العملية في إطار آلة حاسبة الصورة، حدد صورة واحدة كتكديس واحد. في إطار العملية، حدد طرح.
حدد الصورة اثنين كتكدس اثنين. عندما يطلب لضبط التباين، استخدم عناصر التحكم في نافذة التحكم في السطوع لضبط تباين السطوع لصورة الإسقاط القصوى لـ GFP ومتوسط إسقاط بشرة توليد صورة مدمجة RGB لكل من الإشارات التي تظهر GFP باللون الأخضر و بشرة باللون الرمادي. ثم دمج نتائج المكدس واحد واثنين من المكدس لتوليد مجمع GFP و كدسة بشرة التي يمكن استخدامها في المرحلة التالية.
لتصور الساقين في ثلاثة أبعاد، افتح مكدس RGB في برنامج 3D مناسب. في نافذة الحوار المنبثقة، حدد جميع القنوات في قسم تحويل الوضع وأدخل حجم voxel تم الحصول عليها من التحليل السابق. في وحدة قناة واحدة، انقر بزر الماوس الأيمن وحدد عرض وVolren.
ثم غادر انقر على وحدة Volren. في المقطع خصائص، انقر على اليسار على خيارات متقدمة وحدد DDR. ثم اضبط قيمة غاما لرؤية خلفية بشرة.
في وحدة القناة الثانية ، انقر بزر الماوس الأيمن وحدد عرض Volren. ثم غادر انقر على وحدة Volren، تحرير وحدد volrenGreen.col. باستخدام هذا الإجراء، يمكن الجمع بين الإشارة من بشرة مع إشارة GFP لتحديد موضع محاور داخل الساقين.
من المهم للغاية الحصول على الساقين ثابتة بشكل جيد. في الساقين ثابتة بشكل صحيح، والهياكل الداخلية داخل الساقين هي من لون موحد والقصبة الهوائية، والتي هي داكنة، مرئية. في الساقين ثابتة سيئة، والمواد الداكنة موجودة في الترسوس والساق ونظام القصبة الهوائية ليست واضحة للعيان في عظم الفخذ coxa.
الإجراء الذي وصفناه هنا يتغلب على التحدي المتمثل في الكشف عن التعبير الفلورسنت في محاور عصبية المحرك من خلال بشرة فلورية سميكة والسيارات ذات دقة عالية. لذلك فإن إشارة الفلورسنت النظيفة والمفصلة التي تم الحصول عليها تسمح لنا بتصور وكمية ميزة ثلاثية الأبعاد لربور محور عصبي باستخدام برامج التصوير ثلاثية الأبعاد. لذلك هذه التقنية سوف تسمح لنا لاستخدام درسوسوفيليا الكبار كنموذج ليس فقط لدراسة تطوير الخلايا العصبية الحركية, ولكن أيضا لدراسة, لفهم تأثير مرض التنكسية مثل ERAS على النظام الحركي المتكاملة.
