استخدام AAA-ATPases لإزالة البروتينات من طبقة ثنائية الدهون هو موضوع شائع في مراقبة جودة البروتين. ويتطلب الفهم الآلي لهذه العملية الأساسية نظاما أعيد تشكيله. وكانت إعادة التشكيل السابقة مع AAA-ATPases معقدة وغير متجانسة.
نظامنا بسيط ومحدد بالكامل. وهذا يسمح لنا للتلاعب في AAA-ATPase Msp1، الركيزة، والبيئة الدهنية. للبدء، إضافة المخزن المؤقت لإعادة التشكيل المعدة مسبقا، وتنقية Msp1 والبروتينات TA والدهون في أنبوب PCR، ثم احتضان الخليط على الجليد لمدة 10 دقائق.
خلال الحضانة، وقطع غيض من طرف ماصة P200 إلى حوالي 1/8 من شبر واحد في القطر. المقبل، دوامة الأنبوب الذي يحتوي على BioBeads جيدا للحصول على خليط موحد. ثم، بسرعة إزالة الغطاء واستخدام تلميح ماصة P200 قطع لنقل حجم مناسب من الخرز إلى أنبوب PCR فارغة.
بمجرد اكتمال الحضانة لمدة 10 دقائق لإعادة التشكيل ، باستخدام طرف ماصة غير مقطوع ، قم بإزالة جميع السوائل من BioBeads. ثم، نقل 100 ميكرولتر من إعادة تشكيل في أنبوب مع BioBeads والسماح لها بالتناوب على عجلة لمدة 16 ساعة. في اليوم التالي، تدور الأنبوب في PicoFuge بيليه الخرز، ثم نقل المواد المعاد تشكيلها إلى أنبوب PCR نظيفة والحفاظ على أنبوب على الجليد.
لإزالة البروتينات التي فشلت في إعادة تشكيل في الليبوسومات، equilibrate أعمدة تدور الجلوتاثيون مع العازلة استخراج، والذي ينطوي عادة على ثلاث جولات من الغسيل مع 400 ميكرولتر من العازلة، تليها الطرد المركزي لإزالة العازلة. بعد ذلك ، أضف خمسة ميكرومولات من كل مرافق إلى المواد المعاد تشكيلها ، تليها 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للاستخراج ، ليصل حجمها إلى 200 ميكرولتر. أضف هذا الخليط إلى أعمدة الدوران الغلوتاثيونية المتساوية، ثم قم بتوصيل أعمدة الدوران وقم بتدويرها لمدة 30 دقيقة، مما يسمح للمرافقين بالارتباط بالراتنج.
بعد الدوران، قم بتدوير الأعمدة لفترة وجيزة. جمع التدفق من خلال، وهو المواد تطهيرها مسبقا استنفدت من البروتينات المجمعة. وضعه على الجليد والمضي قدما مباشرة إلى المقايسة استخراج.
إعداد أنابيب لتحليل SDS-PAGE. أضف 45 ميكرولتر من الماء المقطر المزدوج إلى أنبوب الإدخال ، و 40 ميكرولتر من الماء إلى الأنبوب المتدفق ، و 16.6 ميكرولتر من مخزن التحميل 4X SDS-PAGE المؤقت لكل أنبوب. بالنسبة لمقاايسة الاستخراج، قم بإعداد رد فعل الاستخراج وإحضار الحجم النهائي إلى 200 ميكرولتر مع المخزن المؤقت للاستخراج.
ثم، قبل الحرب المقايسة استخراج في كتلة الحرارة 30 درجة مئوية لمدة دقيقتين. لبدء المقايسة، أضف ATP إلى تركيز نهائي من ميليمولين. تدور الأنبوب لمدة خمس ثوان في PicoFuge، واحتضانه في 30 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
أثناء الحضانة ، خذ عينة من خمسة ميكرولتر من التفاعل وأضفها إلى أنبوب الإدخال. أيضا، equilibrate عمود واحد تدور الجلوتاثيون لكل عينة في المقايسة استخراج كما هو موضح سابقا. وبمجرد اكتمال الحضانة لمدة 30 دقيقة، أضف 200 ميكرولتر من عازل الاستخراج إلى الأنبوب، ليصل إجمالي الحجم إلى 400 ميكرولتر.
ثم، إضافة هذا التفاعل إلى راتنج الجلوتاثيون متساوية الأضلاع والسماح لها بالتناوب لمدة 30 دقيقة في أربع درجات مئوية. بعد الدوران، قم بتدوير الأعمدة لجمع التدفق من خلال، ثم خذ عينة 10 ميكرولتر للأنبوب التدفقي. غسل الراتنج مرتين مع 400 ميكرولتر من العازلة استخراج، والتخلص من تدفق من خلال بعد كل غسل.
بعد الغسيل الثالث، حافظ على التدفق من خلال وأخذ عينة 50 ميكرولتر للأنبوب غسل. بعد ذلك، قم بإعداد خمسة ملليلترات من العازلة elution بإضافة الجلوتاثيون المنخفض إلى تركيز نهائي من خمسة ملليمولات في المخزن المؤقت للاستخراج. إضافة 200 ميكرولتر من العازلة elution إلى العمود تدور واحتضان لمدة خمس دقائق.
ثم، طرد العمود وجمع التدفق من خلال. كرر خطوة الوضوء مرة أخرى. بعد elution الثاني، واتخاذ aliquot 50 ميكرولتر من عينة elution وإضافته إلى أنبوب elute.
بعد تشغيل لطخة غربية، يمكن تحديد كفاءة الاستخراج من خلال مقارنة كمية الركيزة في الكسر elute مع كسر الإدخال. تظهر الإشارة في التدفق من خلال بعض التباين، ولكن عموما مماثلة لكسر الإدخال، وليس هناك إشارة في كسر الغسيل. عادة، هناك ما يقرب من 10٪ كفاءة استخراج للسيطرة إيجابية وكفاءة استخراج 1-2٪ للسيطرة السلبية.
عندما لا يتم تحسين ظروف إعادة التشكيل، تكون مستويات الاستخراج قابلة للمقارنة بين العينات الإيجابية والسلبية. سمحت هذه التقنية لمختبرنا باختبار الخصائص الفيزيائية الحيوية للركيزة التي تؤثر على التعرف عليها من قبل Msp1.
