O uso de AAA-ATPases para remover proteínas de um bicamheiro lipídico é um tema comum no controle da qualidade das proteínas. Uma compreensão mecanicista desse processo essencial requer um sistema reconstituído. A reconstituição anterior com AAA-ATPases era complexa e heterogênea.
Nosso sistema é simples e totalmente definido. Isso nos permite manipular o AAA-ATPase Msp1, o substrato e o ambiente lipídulo. Para começar, adicione tampão de reconstituição previamente preparado, proteínas Msp1 e TA purificadas e lipossomos em um tubo PCR e, em seguida, incubar a mistura no gelo por 10 minutos.
Durante a incubação, corte a ponta de uma ponta de pipeta P200 para cerca de 1/8 de polegada de diâmetro. Em seguida, o vórtice do tubo contendo BioBeads completamente para obter uma mistura uniforme. Em seguida, remova rapidamente a tampa e use a ponta de pipeta P200 cortada para transferir um volume apropriado das contas para um tubo PCR vazio.
Uma vez que a incubação de 10 minutos para a reconstituição esteja completa, usando uma ponta de pipeta sem cortes, remova todo o líquido das BioBeads. Em seguida, transfira 100 microliters da reconstituição para o tubo com as BioBeads e deixe-a girar em uma roda por 16 horas. No dia seguinte, gire o tubo em um PicoFuge para pelotar as contas, em seguida, transfira o material reconstituído para um tubo PCR limpo e mantenha o tubo no gelo.
Para remover proteínas que não conseguiram reconstituir nos lipossomos, equilibre as colunas de spin de glutationa com tampão de extração, que normalmente envolve três rodadas de lavagem com 400 microliters de tampão, seguidas de centrifugação para remover o tampão. Em seguida, adicione cinco micromoles de cada acompanhante ao material reconstituído, seguido por 100 microliters de tampão de extração, elevando o volume para 200 microlitres. Adicione essa mistura às colunas de giro de glutationa equilibradas, depois conecte as colunas de giro e gire-as por 30 minutos, permitindo que os acompanhantes se liguem à resina.
Após a rotação, gire as colunas brevemente. Recolher o fluxo, que é o material pré-desmatado esgotado de proteínas agregadas. Coloque-o no gelo e prossiga diretamente para o ensaio de extração.
Prepare tubos para análise SDS-PAGE. Adicione 45 microliters de água duplamente destilada ao tubo de entrada, 40 microliters de água ao tubo de fluxo e 16,6 microliters de 4X SDS-PAGE carregando tampão para cada tubo. Para o ensaio de extração, prepare a reação de extração e eleve o volume final para 200 microliters com o tampão de extração.
Em seguida, pré-aqueça o ensaio de extração em um bloco de calor de 30 graus Celsius por dois minutos. Para iniciar o ensaio, adicione ATP a uma concentração final de dois mililitros. Gire o tubo por cinco segundos em um PicoFuge, e incuba-o a 30 graus Celsius por 30 minutos.
Durante a incubação, pegue uma amostra de cinco microliter da reação e adicione-a ao tubo de entrada. Além disso, equilibre uma coluna de spin de glutationa para cada amostra no ensaio de extração, como demonstrado anteriormente. Uma vez que a incubação de 30 minutos esteja completa, adicione 200 microliters de tampão de extração ao tubo, elevando o volume total para 400 microliters.
Em seguida, adicione esta reação à resina de glutationa equilibrada e deixe-a girar por 30 minutos a quatro graus Celsius. Após a rotação, gire as colunas para coletar o fluxo-through e, em seguida, pegue uma amostra de 10 microliter para o tubo de fluxo. Lave a resina duas vezes com 400 microliters de tampão de extração, descartando o fluxo após cada lavagem.
Após a terceira lavagem, mantenha o fluxo e leve uma amostra de 50 microliter para o tubo de lavagem. Em seguida, prepare cinco mililitros de tampão de elução adicionando glutationa reduzida a uma concentração final de cinco milimoles no buffer de extração. Adicione 200 microliters do tampão de elução à coluna de giro e incubar por cinco minutos.
Em seguida, centrifufique a coluna e colete o fluxo. Repita o passo de eluição mais uma vez. Após a segunda eluição, pegue uma alíquota de 50 microliter da amostra de eluição e adicione-a ao tubo de elute.
Depois de executar uma mancha ocidental, a eficiência de extração pode ser determinada comparando a quantidade de substrato na fração de elute com a fração de entrada. O sinal no fluxo mostra alguma variabilidade, mas é geralmente semelhante à fração de entrada, e não há sinal na fração de lavagem. Normalmente, há uma eficiência de extração de aproximadamente 10% para o controle positivo e uma eficiência de extração de um a 2% para o controle negativo.
Quando as condições de reconstituição não são otimizadas, os níveis de extração são comparáveis entre as amostras positivas e negativas. Esta técnica permitiu que nosso laboratório testásse propriedades biofísicas do substrato a afetar o reconhecimento por Msp1.
