Использование AAA-АТФаз для удаления белков из липидного бислоя является общей темой в контроле качества белка. Механистическое понимание этого важнейшего процесса требует воссозданной системы. Предыдущая реконструкция с помощью AAA-ATPases была сложной и неоднородной.
Наша система проста и полностью определена. Это позволяет нам манипулировать AAA-ATPase Msp1, субстратом и липидной средой. Для начала добавьте в ПЦР-трубку предварительно приготовленный восстановительный буфер, очищенные белки msp1 и TA и липосомы, затем инкубируйте смесь на льду в течение 10 минут.
Во время инкубации отрежьте наконечник пипетки P200 примерно до 1/8 дюйма в диаметре. Затем тщательно вихрьте трубку, содержащую bioBeads, чтобы получить однородную смесь. Затем быстро снимите крышку и используйте вырезанный наконечник пипетки P200, чтобы перенести соответствующий объем шариков в пустую трубку ПЦР.
Как только 10-минутная инкубация для восстановления будет завершена, используя неразрезанный наконечник пипетки, удалите всю жидкость из BioBeads. Затем переложите 100 микролитров восстановления в трубку с помощью BioBeads и позвольте ей вращаться на колесе в течение 16 часов. На следующий день вращайте трубку в PicoFuge, чтобы гранулировать бусины, затем перенесите восстановленный материал в чистую трубку ПЦР и держите трубку на льду.
Для удаления белков, которые не смогли восстановиться в липосомах, уравновешивайте спиновые колонки глутатиона экстракционным буфером, который обычно включает в себя три раунда промывки с 400 микролитрами буфера с последующим центрифугированием для удаления буфера. Затем добавьте пять микромолей каждого шаперона к восстановленному материалу, а затем 100 микролитров экстракционного буфера, доведя объем до 200 микролитров. Добавьте эту смесь в уравновешенные спиновые колонки глутатиона, затем заткните спиновые колонны и вращайте их в течение 30 минут, позволяя шаперонам связываться со смолой.
После вращения вращайте колонны ненадолго. Соберите сквозной поток, который представляет собой предварительно очищенный материал, обедненный агрегированными белками. Поместите его на лед и непосредственно приступайте к экстракционному анализу.
Подготовьте трубки для анализа SDS-PAGE. Добавьте 45 микролитров двойной дистиллированной воды во входную трубку, 40 микролитров воды в проточную трубку и 16,6 микролитра 4X SDS-PAGE загрузочного буфера в каждую трубку. Для экстракционного анализа подготовьте реакцию экстракции и доведите конечный объем до 200 микролитров с помощью экстракционного буфера.
Затем предварительно прогрейте экстракционный анализ в тепловом блоке с температурой 30 градусов Цельсия в течение двух минут. Чтобы начать анализ, добавляют АТФ к конечной концентрации в два миллимоля. Вращайте трубку в течение пяти секунд в PicoFuge и высиживайте ее при 30 градусах Цельсия в течение 30 минут.
Во время инкубации возьмите пятимикролитровый образец реакции и добавьте его во входную трубку. Кроме того, уравновешивайте одну спиновую колонку глутатиона для каждого образца в экстракционном анализе, как показано ранее. После завершения 30-минутной инкубации добавьте в трубку 200 микролитров экстракционного буфера, доведя общий объем до 400 микролитров.
Затем добавьте эту реакцию к уравновешенной глутатионной смоле и дайте ей вращаться в течение 30 минут при четырех градусах Цельсия. После вращения раскрутите колонны, чтобы собрать сквозной поток, затем возьмите 10-микролитровый образец для проточной трубки. Промывайте смолу дважды 400 микролитрами экстракционного буфера, отбрасывая проточную поверхность после каждой промывки.
После третьей промывки держите проточную и возьмите 50-микролитровый образец для промывочной трубки. Затем подготовьте пять миллилитров буфера элюирования, добавив восстановленный глутатион к конечной концентрации пяти миллимолей в буфере экстракции. Добавьте 200 микролитров буфера элюирования в спиновую колонку и высиживайте в течение пяти минут.
Затем центрифугируйте колонну и соберите сквозной поток. Повторите шаг элюирования еще раз. После второго элюирования возьмите 50-микролитровую аликвоту из образца элюирования и добавьте ее в трубку элюда.
После проведения вестерн-блот эффективности экстракции можно определить, сравнив количество субстрата в элютивной фракции с входной фракцией. Сигнал в проточном потоке показывает некоторую изменчивость, но в целом похож на входную фракцию, и в дроби промывки нет сигнала. Как правило, существует приблизительно 10% эффективность экстракции для положительного контроля и от одного до 2% эффективности экстракции для отрицательного контроля.
Когда условия восстановления не оптимизированы, уровни экстракции сопоставимы между положительными и отрицательными образцами. Этот метод позволил нашей лаборатории проверить биофизические свойства субстрата, распознающего влияние Msp1.
