脂質二重層からタンパク質を除去するAAA-ATPasesの使用は、タンパク質の品質管理における一般的なテーマです。この本質的なプロセスの機械論的理解には、再構成されたシステムが必要です。AAA-ATPEsによる以前の再構成は複雑で異質であった。
当社のシステムはシンプルで完全に定義されています。これにより、AAA-ATPase Msp1、基質、脂質環境を操作することができます。まず、以前に調製した再構成バッファー、精製 Msp1 および TA タンパク質およびリポソームを PCR チューブに加え、氷上で 10 分間インキュベートします。
インキュベーション中に、P200ピペットチップの先端を直径約1/8インチに切ります。次に、バイオビーズを含むチューブを完全に渦液にして、均一な混合物を得る。次に、蓋を素早く取り外し、カットされたP200ピペットチップを使用して、適切な量のビーズを空のPCRチューブに移します。
10分間の再構成用インキュベーションが完了したら、ノーカットピペットチップを使用して、Bioビーズからすべての液体を取り除きます。その後、再構成の100マイクロリットルをBioビーズでチューブに移し、車輪で16時間回転させます。翌日、ピコフュージでチューブを回転させてビーズをペレット化し、再構成した材料をクリーンなPCRチューブに移し、チューブを氷の上に置きます。
リポソームへの再構成に失敗したタンパク質を除去するために、グルタチオンスピンカラムを抽出バッファで平衡化し、通常は400マイクロリットルのバッファで3ラウンドの洗浄を行い、続いて遠心分離して緩衝液を除去する。次に、再構成された材料に各シャペロンの5マイクロモルを加え、その後に100マイクロリットルの抽出バッファーを加え、最大200マイクロリットルの体積を持ち込みます。この混合物を平衡化したグルタチオンスピンカラムに加え、スピンカラムを差し込んで30分間回転させ、シャペロンを樹脂に結合させます。
回転後、列を短く回転させます。凝集したタンパク質の枯渇したクリア済み材料であるフロースルーを収集します。氷の上に置き、抽出アッセイに直接進みます。
SDS-PAGE分析用のチューブを準備します。入力チューブに45マイクロリットルの二重蒸留水、フロースルーチューブに40マイクロリットルの水、各チューブに4X SDS-PAGEローディングバッファの16.6マイクロリットルを加えます。抽出アッセイの場合、抽出反応を調製し、抽出バッファーで最終容積を 200 マイクロリットルまで持ち出します。
その後、抽出アッセイを摂氏30度の熱ブロックで2分間温めます。アッセイを開始するには、ATPを2ミリモルの最終濃度に加えます。ピコフュージで5秒間チューブを回転させ、30°Cで30分間インキュベートします。
インキュベーション中に、反応の5マイクロリットルのサンプルを取り、入力チューブに加えます。また、先に示したように抽出アッセイ中の各サンプルについて1つのグルタチオンスピンカラムを平衡化する。30分間のインキュベーションが完了したら、200マイクロリットルの抽出バッファーをチューブに加えて、合計容量を400マイクロリットルにします。
次に、この反応を平衡グルタチオン樹脂に加え、摂氏4度で30分間回転させます。回転後、カラムを回転してフロースルーを集め、フロースルーチューブ用に10マイクロリットルのサンプルを取ります。400マイクロリットルの抽出バッファーで樹脂を2回洗浄し、洗浄後にフロースルーを廃棄します。
3回目の洗浄後、フロースルーを維持し、洗浄チューブ用に50マイクロリットルのサンプルを取ります。次に、抽出バッファー内の 5 ミリモルの最終濃度に還元されたグルタチオンを加えることによって溶出バッファーの 5 ミリリットルを準備します。.200マイクロリットルの溶出バッファーをスピンカラムに加え、5分間インキュベートします。
次に、カラムを遠心分離し、フロースルーを収集します。溶出のステップをもう一度繰り返します。2回目の溶出後、溶出サンプルから50マイクロリットルのアリコートを取り出し、それをエルテチューブに加えます。
ウェスタンブロットを実行した後、抽出効率は、エルト分数中の基質の量を入力画分と比較することによって決定することができる。フロースルーの信号はある程度の変動性を示していますが、一般的には入力分数に似ており、洗浄端数には信号がありません。典型的には、陽性対照に対して約10%の抽出効率があり、負の対照には1〜2%の抽出効率がある。
再構成条件が最適化されていない場合、抽出レベルは正サンプルと負サンプルの間で比較可能です。この技術により、私たちの研究室は、Msp1による認識に影響を与える基質の生物物理学的特性をテストすることができました。
