지질 이중층에서 단백질을 제거하기 위해 AAA-ATPases를 사용하는 것은 단백질 품질 관리에서 일반적인 주제입니다. 이 필수 프로세스에 대한 기계적 이해는 재구성된 시스템이 필요합니다. AAA-ATPases와의 이전 재구성은 복잡하고 이질적이었습니다.
우리의 시스템은 간단하고 완벽하게 정의됩니다. 이를 통해 AAA-ATPase Msp1, 기판 및 지질 환경을 조작할 수 있습니다. 시작하려면 이전에 준비된 재구성 버퍼, 정제된 Msp1 및 TA 단백질 및 리포솜을 PCR 튜브에 추가한 다음 혼합물을 얼음에 10분 동안 배양합니다.
인큐베이션 하는 동안, 직경의 인치의 약 1/8에 P200 파이펫 팁의 끝을 잘라. 다음으로, 균일한 혼합물을 얻기 위해 BioBeads를 철저히 함유하는 튜브를 소용돌이시다. 그런 다음 뚜껑을 신속하게 제거하고 절단 된 P200 파이펫 팁을 사용하여 구슬의 적절한 볼륨을 빈 PCR 튜브로 전송합니다.
재구성을 위한 10분 인큐베이션이 완료되면, 절단되지 않은 파이펫 팁을 사용하여 BioBeads에서 모든 액체를 제거합니다. 그런 다음, BioBeads와 튜브로 재구성의 100 마이크로 리터를 전송하고 16 시간 동안 바퀴에 회전 할 수 있습니다. 다음 날, 피코푸지에서 튜브를 회전하여 구슬을 펠릿한 다음 재구성된 재료를 깨끗한 PCR 튜브로 옮기고 튜브를 얼음 위에 보관합니다.
리포솜으로 재구성하지 못한 단백질을 제거하기 위해 글루타티온 스핀 컬럼을 추출 버퍼로 평형화하며, 이는 일반적으로 400 마이크로리터의 완충제로 3라운드를 세척한 다음 원심분리를 통해 버퍼를 제거합니다. 다음으로, 각 샤페론의 5마이크로몰을 재구성된 물질에 추가하고, 100마이크로리터의 추출 버퍼를 추가하여 최대 200마이크로리터의 부피를 가져온다. 이 혼합물을 평형 글루타티온 스핀 컬럼에 추가한 다음 스핀 컬럼을 연결하고 30분 동안 회전하여 샤페론이 수지에 결합할 수 있도록 합니다.
회전 후 열을 짧게 회전합니다. 응집된 단백질의 고갈된 미리 지워진 물질인 흐름을 수집합니다. 얼음 위에 놓고 추출 분석으로 직접 진행합니다.
SDS 페이지 분석을 위해 튜브를 준비합니다. 입력 튜브에 이중 증류수 45마이크로리터, 유동 튜브에 40 마이크로리터, 각 튜브에 4X SDS-PAGE 적재 버퍼16.6 마이크로리터를 추가합니다. 추출 분석의 경우 추출 반응을 준비하고 추출 버퍼로 최종 부피를 200 마이크로리터로 끌어올수 있습니다.
그런 다음 추출 분석체를 섭씨 30도 의 열 블록에서 2 분 동안 미리 데우십시오. 분석작업을 시작하려면 ATP를 2밀리몰의 최종 농도에 추가합니다. 피코푸지에서 5초 동안 튜브를 회전시키고 30분 동안 섭씨 30도에서 배양합니다.
인큐베이션 중에 반응의 5마이크로리터 샘플을 채취하고 입력 튜브에 추가합니다. 또한, 이전에 입증된 바와 같이 추출 분석에서 각 샘플에 대해 하나의 글루타티온 스핀 컬럼을 평형화한다. 30분 분량의 인큐베이션이 완료되면 200마이크로리터의 추출 버퍼를 튜브에 추가하여 총 부피4000마이크로리터를 넣습니다.
그런 다음 평형 글루타티온 수지에 이 반응을 추가하고 섭씨 4도에서 30분 동안 회전할 수 있습니다. 회전 후 컬럼을 회전하여 흐름을 수집한 다음 유동 튜브에 대해 10 마이크로리터 샘플을 채취합니다. 추출 버퍼 400 마이크로리터로 수지를 두 번 세척하여 세척 후 흐름을 폐기합니다.
세 번째 세척 후, 흐름을 유지하고 세척 튜브에 대한 50 마이크로 리터 샘플을 가져 가라. 다음으로, 추출 버퍼에 5 밀리몰의 최종 농도에 감소 된 글루타티온을 추가하여 용출 버퍼의 5 밀리리터를 준비합니다. 용출 버퍼 200 마이크로리터를 스핀 컬럼에 추가하고 5분 동안 배양합니다.
그런 다음 컬럼을 원심분리하고 흐름을 수집합니다. 용출 단계를 다시 한 번 반복합니다. 두 번째 용출 후 용액 샘플에서 50 마이크로 리터 알리코트 (aliquot)를 가져 와서 엘루트 튜브에 추가하십시오.
서부 블롯을 실행한 후, 추출 효율은 엘루트 분획내의 기판의 양을 입력 분획과 비교하여 결정될 수 있다. 유동에서의 신호는 일부 가변성을 나타내지만 일반적으로 입력 분획과 유사하며 세척 분획에는 신호가 없습니다. 전형적으로, 음수 제어를 위한 약 10%의 추출 효율과 음수 제어를 위한 1~2%의 추출 효율이 있다.
재구성 조건이 최적화되지 않은 경우 추출 수준은 양수 샘플과 음수 샘플 간의 비교됩니다. 이 기술은 우리의 실험실이 Msp1에 의한 인식에 영향을 미치는 기판의 생물학적 특성을 시험할 수 있었습니다.
