الهدف من هذا الإجراء هو تحديد إنتاج الجلوكوز الكبدي في متلازمة المبيض المتعدد الكيسات، أو نموذج فأرة متلازمة تكيس المبايض. استقلاب الجلوكوز Dysregulated هو مظهر مهم من مظاهر PCولين المبايض وهو مفتاح الإمراض. لذلك، فإن الدراسات التي تنطوي على تقييم استقلاب الجلوكوز في PCولين الكلور ذات أهمية قصوى.
في هذه الدراسة، نناقش التعليمات خطوة بخطوة لقياس كمي لمعدل إنتاج الجلوكوز الكبدي في نموذج فأرة PC PCOS من خلال قياس M زائد اثنين من إثراء ستة جلوكوز مقلي، أو متتبع جلوكوز نظائري مستقر، عن طريق كروماتوغرافيا الغاز، أو قياس الطيف الكتلي، أو GCMS. يتضمن هذا الإجراء إنشاء محلول مستقر لتتبع الجلوكوز النظيري ، واستخدام موضع قسطرة الوريد الذيل وضخ متتبع الجلوكوز في كل من حالات الصيام والجلوكوز الغنية في نفس الماوس جنبا إلى جنب. قبل يوم واحد من الإجراء، قم بإعداد متتبع الجلوكوز النظيري المستقر في المحلول الملحي الطبيعي.
لهذه التجربة، تم قياس إنتاج الجلوكوز أثناء الصيام في الحالات الغنية بالجلوكوز بحيث تم إعداد نظائر الجلوكوز في إعدادين مختلفين. تم إعداد التتبع في ظل ظروف معقمة عن طريق إذابة ستة جلوكوز معقم وخالي من البيروجين ومحلول كلوريد الصوديوم المعقم بنسبة 0.9٪ مع الجلوكوز أو بدونه. تم إعداد التسريب الأول باستخدام المقتفي فقط.
يحتوي ال infusate الثاني على كل من التتبع جنبا إلى جنب مع الجلوكوز غير النظائر. وبمجرد إعداد الحلول، تم تصفيتها بتصفية معقمة مع مرشح 0.22 ميكرون وتخزينها في أربع درجات مئوية. تم إعداد الحلول بطريقة أن الجرعة النهائية غرس كان ما يقرب من ملليغرام واحد لكل كيلوغرام ودقيقة واثنين ملليغرام للكيلوغرام الواحد والدقيقة على التوالي.
لقياس معدل ظهور الجلوكوز أثناء الحالة القاعدية في حالة غنية بالجلوكوز ، تم استخدام متوسط ضخ معدل ثابت جاهز من ستة جلوكوز مقلي بمعدل 1.08 ملليغرام لكل كيلوغرام ودقيقة و 1.9 ملليغرام للكيلوغرام في الدقيقة على التوالي. من أجل تقليد الدولة التي تغذيها، استخدمنا متوسط معدل ضخ D-الجلوكوز من 18.8 ملليغرام للكيلوغرام الواحد والدقيقة خلال حالة غنية بالجلوكوز. إزالة الفئران من أقفاص منازلهم، ووضعها في أقفاص الصيام قبل ثلاث ساعات من بدء التجربة.
في هذه التجربة ، استخدمنا الفئران الإناث البالغة من العمر أربعة أشهر من سلالة C57BL6J. تجميع معدات caging عن طريق تجميع الفئران في عدد محدد من الفئران لكل مضخة الأنسولين. ضع أقساما فوق قاعدة مسطحة ومستقرة لإنشاء أكشاك فردية للفئران.
الأقفاص واضحة ومصص (مصنوعة من زجاج شبكي) هناك قاعدة مسطحة ومستقرة تجلس عليها الأقسام. الباب إلى قفص الشرائح لإغلاق ولديه درجة في الجزء السفلي للسماح للذيل لتناسب من خلال.
تجميع المحاقن التي تحتوي على ملليلتر واحد من غرس القاعدية، ثم الاتصال ضخ ضخ أنابيب مضخة باستخدام أنابيب البولي ايثيلين. قم بإعداد مضخة التسريب عن طريق ضبط المعدل على 150 ميكرولتر في الساعة ، وهو المعدل الأساسي. سخني حماما مائيا إلى 48 درجة مئوية.
إعداد محطة إدخال القسطرة المتاخمة لحمام المياه التي تحتوي على الإبر قياس 30 نصف بوصة، أنابيب silastic، وبوصة واحدة، شريط نقل واضح. حدد ماوس واحد ووضعه في حامل آمن مع الوصول إلى الذيل. ضع قطعة من الشريط فوق الجزء القريب من الذيل للسماح بمساحة لإدراج القسطرة بشكل أكثر نعاسا.
أحضر الماوس إلى الحمام المائي ، وأدخل الذيل في الحمام المائي لمدة 30 إلى 45 ثانية تقريبا. وهذا يساعد على توسيع الأوعية الدموية الذيل لوضع القسطرة. يجب أن يتم إدخال القسطرة في ظل ظروف معقمة.
مرة واحدة في الذيل الدافئة، وتنظيف الذيل، ووضع مشبك التمساح النحاس بلا أسنان صغيرة كما tourniquet في نهاية قريبة من الذيل. تصور الوريد الذيل الجانبي تحت عدسة مكبرة. ثم أدخل القسطرة بعناية في وريد الذيل، وامسح المحلول برفق لضمان انتظام القسطرة.
التفاف قطعة من شريط النقل حول موقع الإدراج لتأمين القسطرة، وإزالة tourniquet الصغيرة من الذيل. ضع الماوس في قفصه الفردي واغلق الباب المنزلق ، مما يضمن أن الذيل يبرز من خلال الشق ويبقى خارج القفص. ضع قطعة إضافية من الشريط فوق القسطرة بأكملها والذيل لتثبيتها على اللوحة الأساسية للقفص.
افصل التدفق عن قسطرة الوريد الذيل، وضع المشبك الصغير على أنابيب القسطرة الصلصلة لمنع التدفق الخلفي أثناء توصيل الخط المغرس من المضخة. مرة واحدة متصلة بشكل آمن، وإزالة المشبك وتدفق الحل فتيلة الذي يتكون من غرس. تأكد من أن الحل واضح في الأنبوب وليس ملطخا بالدم.
بمجرد ملاحظة خطوط التسريب لتكون تعمل بشكل صحيح، وإزالة الغطاء من الماوس. وضع الفراش القياسية حول الماوس. بدء التسريب مع غرس التي تحتوي على التتبع، وتشغيله لمدة ثلاث ساعات بشكل مستمر.
طوال مدة التسريب ، استمر في التحقق من رفاهية الفئران ، وكذلك خطوط التسريب. تأكد من أن أنابيب التسريب مؤمنة بشكل صحيح وأنه لا يوجد تسرب من نقاط اتصال الخط. بعد اكتمال التسريب الأول ، أوقف التسريب وضع مشبك على أنبوب القسطرة لمنع التدفق العكسي.
إزالة الفئران بلطف من المرفقات دون إزعاج القسطرة من أجل جمع الدم. لهذه التجربة، خضعت الفئران ثقب الوريد الخد باستخدام لانسيت أربعة ملليمترات. جمع ما يقرب من 75 ميكرولتر من الدم في القارورة المطلوبة.
لإلغاء حماية العينات استعدادا لقياس الطيف الكتلي، أضف ما يقرب من 15 ميكرولتر من الدم إلى 500 ميكرولتر من الأسيتون. يمكن استخدام الدم المتبقي للتحقق من مستوى السكر في الدم عن طريق مقياس الجلوكوميتر و / أو جهاز الطرد المركزي لفصل البلازما عن المقايسات الهرمونية المستقبلية. إزالة غرس من مضخات حقنة عن طريق فصل الأنابيب من المحاقن، واستبداله بثاني يحتوي على التتبع جنبا إلى جنب مع الجلوكوز.
كرر خطوات التسريب السابقة باستخدام ضخ الجلوكوز النظائري الغني بالجلوكوز. للوصول إلى حالة ثابتة ، قم بتشغيل بلعة من التسريب الثاني عند 600 ميكرولتر في الساعة لمدة 15 دقيقة. لاحظ وقت البدء لكل مجموعة من الأقفاص.
خفض معدل التسريب إلى 150 ميكرولتر في الساعة لإكمال ثلاث ساعات من إجمالي وقت التسريب. تكرار أخذ عينات الدم كما سبق وصفه. قطع التسريبات، وتطبيق الضغط في مواقع القسطرة حتى يتوقف النزيف، وإعادة الفئران إلى أقفاص منازلهم.
بعد ذلك، يتم إرسال العينات GCMS. حساب الإثراء النظيري لنظائر الجلوكوز تحت ذروة الجلوكوز من قبل GCCMS باستخدام مشتق بنتاسيتات. باختصار، تتضمن هذه الطريقة إعداد مشتق بنتاسيتات الجلوكوز، يليه تحليل العينة باستخدام GCMS في وضع التأين الكيميائي الإيجابي.
يتم إجراء مراقبة أيون انتقائية لنسبة الكتلة إلى الشحنة ، 171 إلى 169 ، لتحديد M بالإضافة إلى اثنين من إثراء نظير الجلوكوز. يتم إجراء جميع القياسات الحركية على افتراض ظروف الحالة الثابتة. حساب إجمالي معدل ظهور الجلوكوز البلازما من M بالإضافة إلى اثنين من إثراء نظائر الجلوكوز والبلازما باستخدام معادلات تخفيف النظائر المعمول بها.
في ظل ظروف الحالة الثابتة ، يفترض أن معدل ظهور الجلوكوز يساوي معدل اختفاء الجلوكوز. معدل إنتاج الجلوكوز الذاتية يساوي إجمالي معدل الجلوكوز البلازما ناقص الجلوكوز الخارجي. ويتضمن الجدول الأول النتائج التمثيلية للدراسة.
يتم التعبير عن جميع الوحدات بالملليغرام لكل كيلوغرام ودقيقة. باستخدام معادلات تخفيف النظائر الموصوفة سابقا ، تم حساب معدل الجلوكوز الكلي في البلازما. في المجموعة الضابطة ، كان متوسط معدل الجلوكوز في المظهر 19.98 في حالة الصيام.
في الظروف الغنية بالجلوكوز ، كان معدل الجلوكوز في المظهر 25.8. كان معدل إنتاج الجلوكوز 19.08 في حالة الصيام و 8.56 في الحالة الغنية بالجلوكوز. استقلاب الجلوكوز غير الطبيعي والتوازن شائعان في متلازمة تكيس المبايض.
في اضطرابات التمثيل الغذائي غير طبيعي الجلوكوز، وتنظيم قمع إنتاج الجلوكوز للخطر مما يؤدي إلى ارتفاع السكر في الدم. في هذه الدراسة، نقوم بوصف طريقة مباشرة لقياس معدل إنتاج الجلوكوز الكبدي في فئران متعددة في نفس الوقت. المكونات الحاسمة لهذه التجربة هي إدخال القسطرة وتحديد القياسات الدقيقة لنظائر الجلوكوز والجلوكوز الطبيعي من أجل إجراء GCMS بشكل كاف.
مزايا الدراسة هو إنجاز التسريب بطريقة طفيفة التوغل بسبب إدخال قسطرة الوريد الذيل، فضلا عن استخدام تتبع الجلوكوز يمكن تحقيقها بسهولة ومستقرة. هناك بعض القيود على الدراسة، بما في ذلك الطلب التقني للإجراء والحاجة إلى مهارات إضافية محتملة. بشكل عام، نحن نصف طريقة واضحة ودقيقة لقياس معدل إجمالي إنتاج الجلوكوز الكبدي في نموذج فأرة PC PCOS.
هذه التقنية يمكن أن تكون بمثابة الأساس لدراسات متعددة تنطوي على استقلاب الجلوكوز من نماذج الماوس.
