Bu prosedürün amacı, polikistik over sendromunda veya PCOS fare modelinde hepatik glikoz üretimini belirlemektir. Düzensiz glikoz metabolizması PKOS'un önemli bir tezahürüdür ve patogenezinin anahtarıdır. Bu nedenle PKOS'ta glikoz metabolizmasının değerlendirilmesini içeren çalışmalar son derece önemlidir.
Bu çalışmada, gaz kromatografisi, kütle spektrometresi veya GCMS aracılığıyla M artı altı kısırlaştırılmış glikoz, kararlı bir izotopik glikoz izleyicisinin M artı iki zenginleştirmesini ölçerek bir PKOS fare modelinde hepatik glikoz üretim oranının ölçülmesi için adım adım talimatlar tartışılmaktadır. Bu prosedür, stabil bir izotopik glukoz izleyici çözeltisinin oluşturulmasını, kuyruk damar kateteri yerleşiminin kullanımını ve aynı farede hem açlık hem de glikoz bakımından zengin durumlarda glikoz izleyicinin infüzyonunu içerir. İşlemden bir gün önce, normal salin içinde kararlı izotop glukoz izleyicisini hazırlayın.
Bu deney için, glikoz bakımından zengin koşullarda oruç sırasında glikoz üretimi ölçüldü, böylece glikoz izotop iki farklı preparat halinde hazırlandı. İzleyici steril ve pirojen içermeyen altı altı döterlenmiş glikoz ve steril% 0.9 sodyum klorür çözeltisi glikozlu veya glikozsuz çözülerek steril koşullar altında hazırlandı. İlk infüzyon sadece izleyici ile hazırlandı.
İkinci infüzyon, nonisotopik glikoz ile birlikte hem izleyiciyi içeriyordu. Çözeltiler hazırlandıktan sonra, 0.22 mikron filtre ile steril filtrelendi ve dört santigrat derecede depolandı. Çözeltiler, son infüzyon dozunu kilogram başına bir miligrama ve dakikaya yakın ve kilogram ve dakika başına iki miligram olacak şekilde hazırlandı.
Glikoz bakımından zengin durumda bazal durum sırasında glikoz görünüm oranı ölçümü için, kilogram başına 1,08 miligram ve dakika ve dakika olarak kilogram başına 1,9 miligram olan altı altı döterlenmiş glikozun astarlı ortalama sabit oran infüzyonu kullanılmıştır. Fed durumunu taklit etmek için, glikoz bakımından zengin durumda kilogram ve dakika başına ortalama 18,8 miligram D-glikoz infüzyon oranına sahip olduk. Fareleri ev kafeslerinden çıkarın ve deneyin başlamasından üç saat önce oruç kafeslerine yerleştirin.
Bu deney için C57BL6J suşundan dört aylık dişi fareler kullandık. Fareleri insülin pompası başına belirli sayıda fareye gruplandırarak kafes ekipmanını monte edin. Fareler için bireysel tezgahlar yapmak için bölümleri düz, kararlı bir tabanın üzerine yerleştirin.
Kafesler berraktır ve pleksiglastan yapılmıştır. Bölümlerin üzerine oturduğu düz, kararlı bir taban vardır. Kafesin kapısı kapanmak için kayar ve kuyruğun sığmasını sağlamak için altta bir çentik vardır.
Bir mililitre bazal infüzyon içeren şırınnaları monte edin, ardından polietilen boruyu kullanarak infüzyon pompası tüpüne bağlanın. İnfüzyon pompasını, bazal hız olan saatte 150 mikrolitreye ayarlayarak hazırlayın. Bir su banyosuz 48 santigrat dereceye ısıtın.
30 ölçer yarım inç iğneler, silastic boru ve bir inç, net taşıma bandı içeren su banyosuna bitişik kateter yerleştirme istasyonunu hazırlayın. Bir fare seçin ve kuyruğa erişimi olan güvenli bir tutucuya yerleştirin. Kateter takılması için daha fazla yer açmak için kuyruğun proksimal kısmının üzerine bir bant parçası yerleştirin.
Fareyi su banyosuna getirin ve kuyruğu yaklaşık 30 ila 45 saniye boyunca su banyosuna yerleştirin. Bu, kateter yerleşimi için kuyruk vaskülatını genişletmeye yardımcı olur. Kateter takılması steril koşullarda yapılmalıdır.
Kuyruk ısındıktan sonra kuyruğu temizleyin ve kuyruğun proksimal ucuna turnike olarak küçük bir bakır dişsiz timsah kelepçesi yerleştirin. Büyüteç altında yanal kuyruk damarını görselleştirin. Daha sonra kateteri kuyruk damarına dikkatlice yerleştirin ve kateterin açıklığını sağlamak için çözeltiyi hafifçe yıkayın.
Kateteri sabitlemek için ekleme bölgesinin etrafına bir parça taşıma bandı sarın ve küçük turnikeyi kuyruktan çıkarın. Fareyi tek tek kafesine yerleştirin ve kayan kapıyı kapatın, kuyruğun çentikten çıkıntılı olmasını ve kafesin dışında kalmasını sağlayın. Kafesin taban plakasına sabitlemek için tüm kateter ve kuyruğun üzerine ek bir bant yerleştirin.
Floşun kuyruk damarı kateterinden çıkarın ve infüzyon hattını pompadan bağlarken geri akışı önlemek için küçük kelepçeyi kateterin silastic tüpüne yerleştirin. Güvenli bir şekilde bağlandıktan sonra, kelepçeyi çıkarın ve infüzyondan oluşan astar çözeltisini yıkayın. Çözeltinin tüpte temiz olduğundan ve kan lekeli olmadığından emin olun.
infüzyon çizgilerinin düzgün çalıştığından, kapağı fareden çıkarın. Farenin etrafına standart yatak takımları yerleştirin. İzleyiciyi içeren infüzyonla infüzyonu başlatın ve sürekli olarak üç saat çalıştırın.
infüzyon süresince, infüzyon hatlarının yanı sıra farelerin refahını kontrol etmeye devam edin. infüzyon borusundan düzgün bir şekilde emin olun ve hat bağlantı noktalarından sızıntı olmamasını sağlayın. İlk infüzyon tamamlandıktan sonra, infüzyonu durdurun ve geri akışı önlemek için kateterin tüpüne bir kelepçe yerleştirin.
Kan toplamak için kateteri bozmadan fareleri muhafazalarından nazikçe çıkardı. Bu deney için, fareler dört milimetrelik bir mızrak kullanarak yanak damarı delinmesi geçirdi. İstediğiniz şişeye yaklaşık 75 mikrolitre kan toplayın.
Kütle spektrometresine hazırlık için örnekleri deproteinize etmek için, 500 aseton mikrolitresine yaklaşık 15 mikrolitre kan ekleyin. Kalan kan, kan şekeri seviyesini glukometre ve/veya santrifüj yoluyla kontrol etmek ve gelecekteki hormon tahlilleri için plazmayı ayırmak için kullanılabilir. Boruyu şırındlardan ayırarak infüzeyi şırınna pompalarından çıkarın ve glikozla birlikte izleyici içeren ikinci infüzyonla değiştirin.
Glikoz bakımından zengin izotopik glukoz infüzyonunu kullanarak önceki infüzyon adımlarını tekrarlayın. Sabit duruma ulaşmak için, 15 dakika boyunca saatte 600 mikrolitrede ikinci infüzyonun bir bolus'ını çalıştırın. Her kafes grubunun başlangıç saatine dikkat edin.
Toplam infüzyon süresinin üç saatini tamamlamak için infüzyon oranını saatte 150 mikrolitreye düşürin. Daha önce açıklandığı gibi kan örneklemesi tekrarlayın. infüzyonları çıkarın, kanama durana kadar kateter bölgelerine basınç uygulayın ve fareleri ev kafeslerine geri verin.
Daha sonra, örnekler GCMS için gönderilir. Glikoz izotopunun glikoz zirvesi altındaki izotopik zenginleştirmesini pentaasetat türevini kullanarak GCCMS tarafından hesaplayın. Kısaca, bu yöntem glikozun pentaasetat türevinin hazırlanmasını ve ardından pozitif kimyasal iyonizasyon modunda GCMS kullanılarak numune analizini içerir.
Kütle-şarj oranının seçici iyon izlemesi, 171 ila 169, Glikoz izotopunun M artı iki zenginleştirilmesini belirlemek için gerçekleştirilir. Tüm kinetik ölçümler sabit durum koşulları varsayılarak gerçekleştirilir. Yerleşik izotop seyreltme denklemlerini kullanarak M artı glikoz izotopunun ve plazmanın iki zenginleştirilmesinden toplam plazma glukoz görünüm oranını hesaplayın.
Sabit durum koşullarında, glikozun ortaya çıkma oranının glikozun kaybolma hızına eşit olduğu varsayılıyor. Endojen glikoz üretim oranı, toplam plazma glikoz oranı eksi eksojen glukoza eşittir. Tablo 1, çalışmanın temsili sonuçlarını içerir.
Tüm birimler kilogram ve dakika başına miligram olarak ifade edilir. Daha önce tanımlanmış izotop seyreltme denklemleri kullanılarak toplam plazma glukoz oranı hesaplandı. Kontrol grubunda ortalama glikoz oranı oruç durumunda 19.98 idi.
Glikoz bakımından zengin koşullarda, görünüm glikoz oranı 25.8 idi. Glikoz üretim oranı açlık durumunda 19.08, glikoz bakımından zengin durumda 8.56 idi. PKOS'ta anormal glikoz metabolizması ve homeostaz yaygındır.
Anormal glikoz metabolizması bozukluklarında, glikoz üretiminin baskılanması düzenlemesi hiperglisemiye yol açan tehlikeye girer. Bu çalışmada, aynı anda birden fazla farede hepatik glikoz üretim oranını ölçmenin basit bir yolunu açıklıyoruz. Bu deneyin kritik bileşenleri kateter takılması ve GCMS'nin yeterince gerçekleştirilmesi için glikoz izotopunun ve doğal glikozun tam ölçümlerinin tanımlanmasıdır.
Çalışmanın avantajları, kuyruk damar kateteri takılması nedeniyle infüzyonu minimal invaziv bir şekilde gerçekleştirmenin yanı sıra kolayca ulaşılabilir, stabil bir glikoz izleyicisi kullanmaktır. Prosedürün teknik talebi ve olası ek becerilere duyulan ihtiyaç da dahil olmak üzere çalışmada bazı sınırlamalar vardır. Genel olarak, bir PCOS fare modelinde toplam hepatik glikoz üretim oranını ölçmenin basit ve doğru bir yolunu açıklıyoruz.
Bu teknik, fare modellerinin glikoz metabolizmasını içeren birden fazla çalışmanın temeli olarak hizmet edebilir.
