Целью этой процедуры является определение производства глюкозы в печени при синдроме поликистозных яичников или мышиной модели СПКЯ. Дисрегулируемый метаболизм глюкозы является важным проявлением СПКЯ и является ключом к его патогенезу. Поэтому исследования, включающие оценку метаболизма глюкозы при СПКЯ, имеют первостепенное значение.
В этом исследовании мы обсуждаем пошаговые инструкции по количественной оценке скорости производства глюкозы в печени в мышиной модели СПКЯ путем измерения M плюс два обогащения шести шести дейтерированных глюкоз, стабильного изотопного индикатора глюкозы, с помощью газовой хроматографии, масс-спектрометрии или GCMS. Эта процедура включает в себя создание стабильного изотопного раствора индикатора глюкозы, использование установки катетера хвостовой вены и инфузию индикатора глюкозы как в состоянии голодания, так и в состояниях, богатых глюкозой, у одной и той же мыши в тандеме. За день до процедуры приготовьте индикатор стабильного изотопа глюкозы в обычном физиологическом растворе.
Для этого эксперимента измеряли выработку глюкозы во время голодания в условиях, богатых глюкозой, поэтому изотоп глюкозы готовили в двух разных препаратах. Индикатор получали в стерильных условиях путем растворения стерильных и не содержащих пирогенов шести шести дейтерированных глюкоз и стерильных 0,9% раствора натрия хлорида с глюкозой или без нее. Первый настой готовили только с помощью индикатора.
Второй инфузия содержала как индикатор, так и неизотопную глюкозу. После того, как растворы были приготовлены, их стерильно фильтровали фильтром 0,22 микрона и хранили при четырех градусах Цельсия. Растворы готовили таким образом, чтобы конечная доза инфузии была близка к одному миллиграмму на килограмм и минуту и двум миллиграммам на килограмм и минуту соответственно.
Для измерения скорости появления глюкозы во время базального состояния в богатом глюкозой состоянии использовалась средняя постоянная скорость инфузии шести шести дейтерированных глюкозы по 1,08 миллиграмма на килограмм и минуту и 1,9 миллиграмма на килограмм в минуту соответственно. Чтобы имитировать кормовое состояние, мы использовали среднюю скорость инфузии D-глюкозы 18,8 миллиграммов на килограмм с минутой во время состояния, богатого глюкозой. Выньте мышей из их домашних клеток и поместите их в клетки для голодания за три часа до начала эксперимента.
Для этого эксперимента мы использовали четырехмесячных самок мышей из штамма C57BL6J. Соберите оборудование для клетки, сгруппировав мышей в определенное количество мышей на инсулиновую помпу. Поместите перегородки поверх плоского, стабильного основания, чтобы сделать отдельные стойла для мышей.
Клетки прозрачные и сделаны из оргстекла. Есть плоское, устойчивое основание, на котором сидят перегородки. Дверь в клетку скользит, чтобы закрыться, и имеет выемку внизу, чтобы позволить хвосту пройти.
Соберите шприцы, содержащие один миллилитр базального инфузизата, затем подключите к трубке инфузионного насоса с помощью полиэтиленовой трубки. Подготовьте инфузионный насос, установив скорость до 150 микролитров в час, что является базальной нормой. Нагрейте водяную баню до 48 градусов по Цельсию.
Подготовьте станцию установки катетера, прилегающую к водяной бане, содержащую полудюймовые иглы 30 калибра, силастические трубки и однодюймовую прозрачную транспортную ленту. Выберите одну мышь и поместите ее в защищенный держатель с доступом к хвосту. Поместите кусок ленты на проксимальную часть хвоста, чтобы освободить место для введения катетера более дистально.
Подведите мышь к водяной бане и вставьте хвост на водяную баню примерно на 30-45 секунд. Это помогает расширить сосудистую систему хвоста для установки катетера. Установка катетера должна производиться в стерильных условиях.
Как только хвост нагреется, очистите хвост и поместите небольшой медный беззубый зажим аллигатора в качестве жгута на проксимальном конце хвоста. Визуализируйте боковую хвостовую жилку под увеличительным стеклом. Затем осторожно вставьте катетер в хвостовую вену, и аккуратно промойте раствор, чтобы обеспечить проходимость катетера.
Оберните кусок транспортной ленты вокруг места введения, чтобы закрепить катетер, и снимите небольшой жгут с хвоста. Поместите мышь в ее индивидуальную клетку и закройте раздвижную дверь, убедившись, что хвост выступает через выемку и остается за пределами клетки. Поместите дополнительный кусок ленты на весь катетер и хвост, чтобы закрепить его на опорной пластине клетки.
Отсоедините смыв от катетера хвостовой вены и поместите небольшой зажим на силастическую трубку катетера, чтобы предотвратить обратный поток при подключении инфузионной линии к насосу. После надежного соединения снимите зажим и промойте грунтовочный раствор, который состоит из настоя. Убедитесь, что раствор прозрачен в пробирке и не окрашен кровью.
Как только линии инфузии будут отмечены, что они функционируют должным образом, снимите крышку с мыши. Разместите стандартную постельную принадлежность вокруг мыши. Начните инфузию с инфузии, содержащей индикатор, и запускайте его в течение трех часов непрерывно.
На время инфузии продолжайте проверять самочувствие мышей, а также линии инфузии. Убедитесь, что инфузионная трубка надежно закреплена и что нет утечек из точек подключения линии. После завершения первой инфузии остановите инфузию и поместите зажим на трубку катетера, чтобы предотвратить обратный поток.
Осторожно удалил мышей из их вольеров, не нарушая катетер, чтобы собрать кровь. Для этого эксперимента мыши подверглись проколу щечных вен с использованием четырехмиллиметрового ланцета. Соберите примерно 75 микролитров крови в желаемый флакон.
Для депротеинизации образцов при подготовке к масс-спектрометрии добавляют примерно 15 микролитров крови к 500 микролитрам ацетона. Оставшаяся кровь может быть использована для проверки уровня глюкозы в крови с помощью глюкометра и / или центрифуги для разделения плазмы для будущих гормональных анализов. Удалите инфузию из шприцевых насосов, отсоединив трубку от шприцев, и замените ее вторым инфузистом, содержащим индикатор вместе с глюкозой.
Повторите предыдущие этапы инфузии, используя богатую глюкозой изотопную инфузию глюкозы. Чтобы достичь устойчивого состояния, запускайте болюс второго инфузии по 600 микролитров в час в течение 15 минут. Обратите внимание на время начала для каждой группы клеток.
Уменьшите скорость инфузии до 150 микролитров в час, чтобы завершить три часа общего времени инфузии. Повторный забор крови, как описано ранее. Отсоедините инфузии, надавите на участки катетера до тех пор, пока кровотечение не прекратится, и верните мышей в их домашние клетки.
Далее образцы отправляются на GCMS. Рассчитать изотопное обогащение изотопа глюкозы при пике глюкозы С помощью GCCMS с использованием производного пентаацетата. Вкратце, этот метод включает в себя получение пентаацетатного производного глюкозы с последующим анализом образца с использованием GCMS в режиме положительной химической ионизации.
Селективный ионный мониторинг отношения массы к заряду, 171 к 169, выполняется для определения М плюс два обогащения изотопа глюкозы. Все кинетические измерения выполняются в стационарных условиях. Рассчитайте общую скорость появления глюкозы в плазме из M плюс два обогащения изотопа глюкозы и плазмы, используя установленные уравнения разбавления изотопов.
В установившихся условиях предполагается, что скорость появления глюкозы равна скорости исчезновения глюкозы. Скорость выработки эндогенной глюкозы равна общей норме глюкозы плазмы минус экзогенная глюкоза. В первую таблицу включены репрезентативные результаты исследования.
Все единицы выражаются в миллиграмме на килограмм и минуту. Используя ранее описанные уравнения разбавления изотопов, была рассчитана общая норма глюкозы в плазме. В контрольной группе средний уровень глюкозы при появлении составил 19,98 в состоянии натощак.
В условиях, богатых глюкозой, показатель появления глюкозы составлял 25,8. Скорость производства глюкозы составила 19,08 в состоянии натощак и 8,56 в состоянии, богатом глюкозой. Аномальный метаболизм глюкозы и гомеостаз распространены при СПКЯ.
При нарушениях аномального метаболизма глюкозы нарушается регуляция подавления выработки глюкозы, что приводит к гипергликемии. В этом исследовании мы описываем простой способ измерения скорости производства глюкозы в печени у нескольких мышей одновременно. Важнейшими компонентами этого эксперимента являются введение катетера и определение точных измерений изотопа глюкозы и естественной глюкозы для адекватного выполнения GCMS.
Преимуществами исследования является выполнение инфузии минимально инвазивным способом за счет введения катетера хвостовой вены, а также использование легкодоступного, стабильного индикатора глюкозы. Существуют некоторые ограничения для исследования, в том числе техническая потребность в процедуре и потребность в возможных дополнительных навыках. В целом, мы описываем простой и точный способ измерения скорости общего производства глюкозы в печени в модели мыши с СПКЯ.
Этот метод может послужить основой для многочисленных исследований, включающих метаболизм глюкозы мышиных моделей.
