Le but de cette procédure est de déterminer la production hépatique de glucose dans un syndrome des ovaires polykystiques, ou modèle murin SOPK. Le métabolisme du glucose dérégulé est une manifestation importante du SOPK et est la clé de sa pathogenèse. Par conséquent, les études impliquant une évaluation du métabolisme du glucose dans le SOPK sont de la plus haute importance.
Dans cette étude, nous discutons des instructions étape par étape pour la quantification du taux de production hépatique de glucose dans un modèle murin SOPK en mesurant l’enrichissement M plus deux de six six glucose deutérés, un traceur de glucose isotopique stable, par chromatographie en phase gazeuse, spectrométrie de masse ou SMGC. Cette procédure implique la création d’une solution de traceur de glucose isotopique stable, l’utilisation de la mise en place d’un cathéter de veine caudale et la perfusion du traceur de glucose à jeun et riche en glucose chez la même souris en tandem. Un jour avant la procédure, préparez le traceur de glucose isotopique stable dans une solution saline normale.
Pour cette expérience, la production de glucose pendant le jeûne dans des conditions riches en glucose a été mesurée, de sorte que l’isotope du glucose a été préparé dans deux préparations différentes. Le traceur a été préparé dans des conditions stériles en dissolvant six six six matériaux de glucose deutérés stériles et une solution stérile de chlorure de sodium à 0,9 % avec ou sans glucose. Le premier infuseur a été préparé avec seulement le traceur.
Le deuxième infusat contenait à la fois le traceur et le glucose non isotopique. Une fois les solutions préparées, elles ont été filtrées stériles avec le filtre de 0,22 micron et stockées à quatre degrés Celsius. Les solutions ont été préparées de manière à ce que la dose finale d’infusion soit proche d’un milligramme par kilogramme et minute et de deux milligrammes par kilogramme et minute respectivement.
Pour la mesure du taux d’apparition du glucose pendant l’état basal dans un état riche en glucose, une perfusion moyenne à débit constant amorcée de six six glucose deutérés à 1,08 milligramme par kilogramme et minute et 1,9 milligrammes par kilogramme en minute respectivement ont été utilisés. Afin d’imiter l’état nourri, nous avons utilisé un taux moyen de perfusion de D-glucose de 18,8 milligrammes par kilogramme et par minute pendant une condition riche en glucose. Retirez les souris de leurs cages d’origine et placez-les dans leurs cages de jeûne trois heures avant le début de l’expérience.
Pour cette expérience, nous avons utilisé des souris femelles de quatre mois de la souche C57BL6J. Assemblez l’équipement de mise en cage en regroupant les souris en un nombre défini de souris par pompe à insuline. Placez des cloisons sur une base plate et stable pour faire des stalles individuelles pour les souris.
Les cages sont claires et en plexiglas. Il y a une base plate et stable sur laquelle reposent les cloisons. La porte de la cage glisse pour se fermer et a une encoche en bas pour permettre à la queue de passer à travers.
Assemblez les seringues contenant un millilitre d’infusat basal, puis connectez-les au tuyau de la pompe à perfusion à l’aide du tube en polyéthylène. Préparez la pompe à perfusion en réglant le débit à 150 microlitres par heure, qui est le taux basal. Chauffer un bain-marie à 48 degrés Celsius.
Préparez la station d’insertion du cathéter adjacente au bain-marie contenant les aiguilles d’un demi-pouce de calibre 30, les tubes silastics et le ruban de transport transparent d’un pouce. Sélectionnez une souris et placez-la dans un support sécurisé avec accès à la queue. Placez un morceau de ruban adhésif sur la partie proximale de la queue pour laisser de l’espace pour l’insertion du cathéter de manière plus distale.
Amenez la souris au bain-marie et insérez la queue dans le bain-marie pendant environ 30 à 45 secondes. Cela aide à dilater le système vasculaire de la queue pour la mise en place du cathéter. L’insertion du cathéter doit se faire dans des conditions stériles.
Une fois la queue réchauffée, nettoyez la queue et placez une petite pince d’alligator sans dents en cuivre comme garrot à l’extrémité proximale de la queue. Visualisez la veine latérale de la queue sous une loupe. Ensuite, insérez soigneusement le cathéter dans la veine caudale et rincez doucement la solution pour assurer la perméabilité du cathéter.
Enroulez un morceau de ruban de transport autour du site d’insertion pour fixer le cathéter et retirez le petit garrot de la queue. Placez la souris dans sa cage individuelle et fermez la porte coulissante, en vous assurant que la queue dépasse à travers l’encoche et reste à l’extérieur de la cage. Placez un morceau de ruban adhésif supplémentaire sur l’ensemble du cathéter et de la queue pour le fixer à la plaque de base de la cage.
Débranchez la chasse d’eau du cathéter de la veine caudale et placez la petite pince sur le tube silastique du cathéter pour éviter le refoulement tout en connectant la conduite d’infusion de la pompe. Une fois bien connecté, retirez la pince et rincez la solution d’amorçage qui se compose de l’infuseur. Assurez-vous que la solution est claire dans le tube et non tachée de sang.
Une fois que les lignes de perfusion sont notées pour fonctionner correctement, retirez le couvercle de la souris. Placez la literie standard autour de la souris. Commencez la perfusion avec l’infuseur contenant le traceur et faites-le fonctionner pendant trois heures en continu.
Pendant toute la durée de la perfusion, continuez à vérifier le bien-être des souris, ainsi que les lignes de perfusion. Assurez-vous que le tuyau de perfusion est correctement fixé et qu’il n’y a pas de fuites des points de connexion de la ligne. Une fois la première perfusion terminée, arrêtez la perfusion et placez une pince sur le tube du cathéter pour éviter le refoulement.
Retirez doucement les souris de leur enclos sans perturber le cathéter afin de recueillir du sang. Pour cette expérience, les souris ont subi une ponction veineuse de la joue à l’aide d’une lancette de quatre millimètres. Recueillez environ 75 microlitres de sang dans le flacon souhaité.
Pour déprotéiniser les échantillons en préparation de la spectrométrie de masse, ajoutez environ 15 microlitres de sang à 500 microlitres d’acétone. Le sang restant peut être utilisé pour vérifier la glycémie via un glucomètre et / ou une centrifugeuse pour séparer le plasma pour de futurs tests hormonaux. Retirez l’infusat des pompes à seringues en déconnectant le tube des seringues et remplacez-le par le deuxième traceur contenant de l’infusat avec du glucose.
Répétez les étapes de perfusion précédentes à l’aide de la perfusion de glucose isotopique riche en glucose. Pour atteindre l’état d’équilibre, exécutez un bolus du deuxième infusat à 600 microlitres par heure pendant 15 minutes. Notez l’heure de début de chaque groupe de cages.
Diminuer le débit de perfusion à 150 microlitres par heure pour compléter les trois heures de temps total de perfusion. Répétez le prélèvement sanguin comme décrit précédemment. Déconnectez les perfusions, appliquez une pression sur les sites du cathéter jusqu’à ce que le saignement cesse et ramenez les souris dans leurs cages d’origine.
Ensuite, les échantillons sont envoyés pour GCMS. Calculer l’enrichissement isotopique de l’isotope du glucose sous pic de glucose par GCCMS en utilisant le dérivé pentaacétate. En bref, cette méthode implique la préparation du dérivé pentaacétate du glucose, suivie d’une analyse d’échantillon à l’aide de GCMS en mode d’ionisation chimique positive.
La surveillance sélective des ions du rapport masse-charge, 171 à 169, est effectuée pour déterminer l’enrichissement M plus deux de l’isotope du glucose. Toutes les mesures cinétiques sont effectuées en supposant des conditions d’état d’équilibre. Calculer le taux d’apparition de la glycémie plasmatique totale à partir du M plus deux enrichissements de l’isotope du glucose et du plasma à l’aide des équations de dilution isotopiques établies.
Dans des conditions d’équilibre, on suppose que le taux d’apparition du glucose est égal au taux de disparition du glucose. Le taux de production endogène de glucose est égal au taux de glucose plasmatique total moins le glucose exogène. Le premier tableau comprend les résultats représentatifs de l’étude.
Toutes les unités sont exprimées en milligrammes par kilogramme et par minute. À l’aide d’équations de dilution isotopique décrites précédemment, le taux de glucose plasmatique total a été calculé. Dans le groupe témoin, le taux de glucose moyen d’apparition était de 19,98 à jeun.
Dans les conditions riches en glucose, le taux d’apparition du glucose était de 25,8. Le taux de production de glucose était de 19,08 à jeun et de 8,56 à l’état riche en glucose. Le métabolisme anormal du glucose et l’homéostasie sont fréquents dans le SOPK.
Dans les troubles du métabolisme anormal du glucose, la régulation de la suppression de la production de glucose est compromise, ce qui entraîne une hyperglycémie. Dans cette étude, nous décrivons un moyen simple de mesurer le taux de production hépatique de glucose chez plusieurs souris en même temps. Les composants critiques de cette expérience sont l’insertion du cathéter et la définition des mesures exactes de l’isotope du glucose et du glucose naturel afin d’effectuer correctement le SMGC.
Les avantages de l’étude sont d’accomplir la perfusion d’une manière peu invasive en raison de l’insertion du cathéter de la veine caudale, ainsi que de l’utilisation d’un traceur de glucose stable et facilement accessible. Il y a certaines limites à l’étude, y compris la demande technique de la procédure et le besoin de compétences supplémentaires possibles. Dans l’ensemble, nous décrivons un moyen simple et précis de mesurer le taux de production totale de glucose hépatique dans un modèle murin SOPK.
Cette technique pourrait servir de base à de multiples études portant sur le métabolisme du glucose de modèles murins.
