이 절차의 목표는 다낭성 난소 증후군, 또는 PCOS 마우스 모형에 있는 간 포도당 생산을 결정하는 것입니다. Dysregulated 포도당 물질 대사는 PCOS의 중요한 표현이고 그것의 병기발생에 열쇠입니다. 따라서, PCOS에서 포도 당 물질 대사의 평가와 관련 된 연구는 가장 중요 한.
이 연구에서는 가스 크로마토그래피, 질량 분석법 또는 GCMS를 통해 6개의 유족 포도당, 안정적인 동위원소 포도당 추적기의 M 플러스 2개의 농축을 측정하여 PCOS 마우스 모델에서 간 포도당 생산 속도의 정량화를 위한 단계별 지침을 논의합니다. 이 절차는 안정적인 동위원소 포도당 추적제 용액의 생성, 꼬리 정맥 카테터 배치 의 사용 및 같은 마우스에서 금식 및 포도당이 풍부한 상태 모두에서 포도당 추적자의 주입을 포함한다. 시술 하루 전에, 정상 식염수에 안정된 동위원소 포도당 추적자를 준비합니다.
이 실험을 위해, 포도당이 풍부한 조건에서 금식 하는 동안 포도당 생산을 측정 하 고 포도 당 동위 원소 두 개의 다른 준비에서 준비 되었다. 트레이서들은 멸균 및 파이로겐이 없는 6개의 중음포도당 및 멸균 0.9%의 염화나트륨 용액을 포도당 유무에 관계없이 용해시킴으로써 멸균 조건하에서 제조하였다. 첫 번째 인퓨아테는 트레이서만 으로 준비하였다.
두 번째 비중화는 비이소토성 포도당과 함께 추적자를 모두 포함했다. 일단 해결책이 준비되면, 그들은 0.22 미크론 필터로 여과하고 섭씨 4도에 저장멸하였다. 용액은 최종 주입 복용량킬로그램 당 1 밀리 그램에 가까운 것 같은 방법으로 준비 하 고 분 당 킬로그램과 분 당 2 밀리 그램.
포도당이 풍부한 상태에서 기저 조건 동안 포도당 외관 속도 측정을 위해, 킬로그램 당 1.08 밀리그램과 분당 1.9 밀리그램에서 6개의 중음포도당의 프라이밍 평균 일정한 비율 주입을 분단위로 각각 사용했습니다. 공급 상태를 모방하기 위해, 우리는 포도당이 풍부한 상태 동안 킬로그램 당 18.8 밀리그램과 분의 평균 D 포도당 주입률을 사용했습니다. 홈 케이지에서 마우스를 제거하고 실험 시작 3 시간 전에 금식 케이지에 놓습니다.
이 실험을 위해, 우리는 C57BL6J 균주에서 4 개월 된 암컷 마우스를 사용했다. 인슐린 펌프당 마우스의 집합 수로 마우스를 그룹화하여 caging 장비를 조립한다. 평평하고 안정적인 베이스 위에 파티션을 배치하여 생쥐의 개별 노점을 만듭니다.
케이지는 명확하고 플렉시 유리로 만들어집니다. 파티션이 있는 평평하고 안정적인 베이스가 있습니다. 케이지의 문이 닫히고 꼬리가 들어갈 수 있도록 바닥에 노치가 있습니다.
기저 비소 1밀리리터가 들어있는 주사기를 조립한 다음 폴리에틸렌 튜브를 사용하여 주입 펌프 튜브에 연결합니다. 시간당 150 마이크로리터로 속도를 설정하여 주입 펌프를 준비합니다. 수조를 섭씨 48도로 가열합니다.
30 게이지 반인치 바늘, 살약 튜브 및 1인치 의 투명한 운송 테이프가 들어 있는 수조에 인접한 카테터 삽입 스테이션을 준비합니다. 마우스 하나를 선택하고 꼬리에 액세스 할 수있는 보안 홀더에 배치합니다. 카테터 삽입공간을 더 dis탈리게 할 수 있도록 꼬리의 근위 부분에 테이프 조각을 놓습니다.
마우스를 수조에 가져와 서 약 30~45초 동안 수조에 꼬리를 삽입합니다. 이것은 카테터 배치를 위한 꼬리 혈관을 넓이시키는 것을 돕습니다. 카테터 삽입은 멸균 조건하에서 수행해야 합니다.
꼬리가 따뜻해지면 꼬리를 청소하고 꼬리의 근간끝에 지혈대로 작은 구리 이빨이 없는 악어 클램프를 놓습니다. 돋보기 아래에 측면 꼬리 정맥을 시각화합니다. 그런 다음 카테터를 테일 정맥에 조심스럽게 삽입하고 용액을 부드럽게 플러시하여 카테터의 가제성을 보장합니다.
카테터를 고정하고 꼬리에서 작은 지혈대를 제거하기 위해 삽입 부위 주위에 전송 테이프 조각을 감쌉니다. 마우스를 개별 케이지에 놓고 슬라이딩 도어를 닫아 꼬리가 노치를 통해 튀어 나와 케이지 외부에 남아 있는지 확인합니다. 카테터 전체와 꼬리에 테이프를 추가하여 케이지의 베이스 플레이트에 고정합니다.
꼬리 정맥 카테터에서 플러시를 분리하고, 펌프에서 인퓨아산 라인을 연결하는 동안 역류를 방지하기 위해 카테터의 silastic 튜브에 작은 클램프를 배치합니다. 단단히 연결되면 클램프를 제거하고 인퓨산으로 구성된 프라이밍 솔루션을 플러시합니다. 용액이 튜브에 명확하고 혈액 얼룩이 아닌지 확인하십시오.
주입 선이 제대로 작동하도록 되면 마우스에서 덮개를 제거합니다. 표준 침구를 마우스 주위에 놓습니다. 추적자를 포함하는 주입을 시작하고 3 시간 동안 계속 실행합니다.
주입 의 기간 동안, 쥐의 웰빙을 확인 계속, 뿐만 아니라 주입 라인. 주입 튜브가 제대로 고정되어 있고 라인 연결 지점에서 누출이 없는지 확인합니다. 첫 번째 주입이 완료된 후 주입을 중지하고 카테터의 튜브에 클램프를 배치하여 역류를 방지합니다.
혈액을 수집하기 위해 카테터를 방해하지 않고 인클로저에서 마우스를 부드럽게 제거했습니다. 이 실험을 위해, 마우스는 4 mm 랜싯을 사용하여 뺨 정맥 구멍을 겪었습니다. 원하는 유리병에 약 75 마이크로리터의 혈액을 수집합니다.
질량 분광법을 준비하기 위해 시료를 단백질화하려면 약 15 마이크로리터의 혈액을 아세톤 500 마이크로리터에 추가합니다. 남은 혈액은 글루코프터 및/또는 원심분리기를 통해 향후 호르몬 분석약을 위해 혈장 분리를 통해 혈당 수준을 확인하는 데 사용할 수 있습니다. 주사기에서 튜브를 분리하여 주사기 펌프에서 인퓨아를 제거하고 포도당과 함께 추적자를 포함하는 두 번째 비혼으로 교체하십시오.
포도당이 풍부한 동위원소 포도당 주입을 사용하여 이전 주입 단계를 반복하십시오. 안정된 상태에 도달하기 위해, 15 분 동안 시간당 600 마이크로 리터에서 두 번째 불경유의 볼러스를 실행합니다. 각 케이지 그룹의 시작 시간을 기록합니다.
총 주입 시간의 3 시간을 완료하기 위해 시간당 150 마이크로 리터로 주입 속도를 감소. 이전에 설명한 바와 같이 혈액 샘플링을 반복합니다. 주입을 분리하고 출혈이 멈출 때까지 카테터 부위에 압력을 가하고 마우스를 홈 케이지로 되돌려 놓습니다.
다음으로 GCMS에 대한 샘플이 전송됩니다. 감타세테이트 유도체를 이용하여 GCCMS에 의해 포도당 피크 하에서 포도당 동위원소의 동위원소 농축을 계산한다. 간단히, 이 방법은 포도당의 펜타세테이트 유도체의 준비를 포함하고, 양양성 화학 이온화 모드에서 GCMS를 이용한 샘플 분석이 뒤따릅니다.
질량 대 전하 비율의 선택적 이온 모니터링, 171 대 169, 포도당 동위원소의 M 플러스 2 농축을 결정하기 위해 수행된다. 모든 운동 측정은 안정된 상태 조건을 가정하여 수행됩니다. M에서 총 플라즈마 포도당 외관 비율을 계산하고 확립된 동위원소 희석 방정식을 사용하여 포도당 동위원소와 플라즈마의 2개의 농축을 계산합니다.
꾸준한 상태 조건하에서, 포도당의 외관의 비율은 포도당의 실종의 비율과 동일하다는 것을 가정합니다. 내인성 포도당 생산의 비율은 총 혈장 포도당 비율을 뺀 외인성 포도당과 동일합니다. 표 1에는 연구의 대표적인 결과가 포함됩니다.
모든 유닛은 킬로그램과 분당 밀리그램으로 표현됩니다. 이전에 설명된 동위원소 희석 방정식을 사용하여 총 혈장 포도당 비율을 계산하였다. 대조군에서, 외관의 평균 포도당 비율은 단식 상태에서 19.98이었다.
포도당이 풍부한 조건에서, 외관의 포도당 비율은 25.8이었습니다. 포도당 생산율은 금식 상태에서 19.08, 포도당이 풍부한 상태에서 8.56이었다. 비정상적인 포도당 대사와 항상성 PCOS에서 일반적입니다.
비정상적인 포도당 대사의 장애에서, 포도 당 생산의 억제의 조절은 고혈당증으로 이어지는 손상. 이 연구에서는, 우리는 동시에 다중 마우스에 있는 간 포도당 생산의 비율을 측정하는 간단한 방법을 기술합니다. 이 실험의 중요한 구성 요소는 GCMS를 적절히 수행하기 위해 포도당 동위원소 및 천연 포도당의 정확한 측정을 카테터 삽입 및 정의하는 것입니다.
연구의 장점은 꼬리 정맥 카테터 삽입으로 인해 최소 침습 적 방식으로 주입뿐만 아니라 쉽게 달성 할 수있는 안정적인 포도당 추적기의 사용입니다. 절차에 대한 기술적 요구와 가능한 추가 기술이 필요한 것을 포함하여 연구에 몇 가지 제한이 있습니다. 전반적으로, 우리는 PCOS 마우스 모형에 있는 총 간 포도당 생산의 비율을 측정하는 간단하고 정확한 방법을 기술합니다.
이 기술은 마우스 모형의 포도당 물질 대사를 관련시키는 다중 연구 결과를 위한 기초역할을 할 수 있었습니다.
