El objetivo de este procedimiento es determinar la producción hepática de glucosa en un síndrome de ovario poliquístico o modelo de ratón con SOP. El metabolismo desregulado de la glucosa es una manifestación importante del SOP y es clave para su patogénesis. Por lo tanto, los estudios que involucran la evaluación del metabolismo de la glucosa en el SOP son de suma importancia.
En este estudio, discutimos las instrucciones paso a paso para la cuantificación de la tasa de producción de glucosa hepática en un modelo de ratón con SOP midiendo el enriquecimiento M más dos de seis seis glucosa deuterada, un trazador de glucosa isotópica estable, a través de cromatografía de gases, espectrometría de masas o GCMS. Este procedimiento implica la creación de una solución trazadora de glucosa isotópica estable, el uso de la colocación del catéter de la vena de la cola y la infusión del marcador de glucosa en estados de ayuno y ricos en glucosa en el mismo ratón en tándem. Un día antes del procedimiento, prepare el marcador de glucosa de isótopos estables en solución salina normal.
Para este experimento, se midió la producción de glucosa durante el ayuno en condiciones ricas en glucosa, por lo que el isótopo de glucosa se preparó en dos preparaciones diferentes. El trazador se preparó en condiciones estériles disolviendo seis seis glucosa deuterada estériles y libres de pirógenos y solución estéril de cloruro de sodio al 0,9% con o sin glucosa. La primera infusión se preparó solo con el trazador.
La segunda infusión contenía tanto el marcador como la glucosa no isotópica. Una vez preparadas las soluciones, se filtraban estérilmente con el filtro de 0,22 micras y se almacenaban a cuatro grados centígrados. Las soluciones se prepararon de tal manera que la dosis final de infusión fue cercana a un miligramo por kilogramo y minuto y dos miligramos por kilogramo y minuto respectivamente.
Para la medición de la tasa de aparición de glucosa durante la condición basal en condición rica en glucosa, se utilizó una infusión de velocidad constante promedio cebada de seis seis glucosa deuterada a 1.08 miligramos por kilogramo y minuto y 1.9 miligramos por kilogramo en minuto respectivamente. Para imitar el estado alimentado, empleamos una tasa promedio de infusión de D-glucosa de 18.8 miligramos por kilogramo y minuto durante la condición rica en glucosa. Retire a los ratones de sus jaulas caseras y colóquelos en sus jaulas de ayuno tres horas antes del inicio del experimento.
Para este experimento, utilizamos ratones hembra de cuatro meses de edad de la cepa C57BL6J. Ensamble el equipo de jaula agrupando a los ratones en un número determinado de ratones por bomba de insulina. Coloque particiones sobre una base plana y estable para hacer puestos individuales para los ratones.
Las jaulas son transparentes y están hechas de plexiglás. Hay una base plana y estable sobre la que se asientan las particiones. La puerta de la jaula se desliza para cerrarse y tiene una muesca en la parte inferior para permitir que la cola quepa.
Ensamble las jeringas que contienen un mililitro de infusión basal, luego conéctelas a la tubería de la bomba de infusión utilizando la tubería de polietileno. Prepare la bomba de infusión ajustando la velocidad a 150 microlitros por hora, que es la velocidad basal. Calienta un baño de agua a 48 grados centígrados.
Prepare la estación de inserción del catéter adyacente al baño de agua que contiene las agujas de media pulgada de calibre 30, el tubo silástico y la cinta de transporte transparente de una pulgada. Seleccione un ratón y colóquelo en un soporte seguro con acceso a la cola. Coloque un trozo de cinta adhesiva sobre la porción proximal de la cola para dejar espacio para la inserción del catéter de manera más distal.
Lleve el ratón al baño de agua e inserte la cola en el baño de agua durante aproximadamente 30 a 45 segundos. Esto ayuda a dilatar la vasculatura de la cola para la colocación del catéter. La inserción del catéter debe realizarse en condiciones estériles.
Una vez que la cola se haya calentado, limpie la cola y coloque una pequeña abrazadera de cocodrilo sin dientes de cobre como torniquete en el extremo proximal de la cola. Visualiza la vena lateral de la cola bajo una lupa. Luego, inserte cuidadosamente el catéter en la vena de la cola y enjuague la solución suavemente para garantizar la permeabilidad del catéter.
Envuelva un trozo de cinta de transporte alrededor del sitio de inserción para asegurar el catéter y retire el pequeño torniquete de la cola. Coloque el ratón en su jaula individual y cierre la puerta corredera, asegurándose de que la cola sobresalga a través de la muesca y permanezca fuera de la jaula. Coloque un trozo adicional de cinta adhesiva sobre todo el catéter y la cola para asegurarlo a la placa base de la jaula.
Desconecte el enjuague del catéter de la vena de la cola y coloque la pinza pequeña en el tubo silástico del catéter para evitar el reflujo mientras conecta la línea de infusión de la bomba. Una vez que esté bien conectado, retire la abrazadera y enjuague la solución de cebado que consiste en la infusión. Asegúrese de que la solución sea transparente en el tubo y no esté manchada de sangre.
Una vez que se observe que las líneas de infusión funcionan correctamente, retire la cubierta del mouse. Coloque la ropa de cama estándar alrededor del mouse. Comience la infusión con la infusión que contiene el marcador y ejecútela durante tres horas continuas.
Durante la duración de la infusión, continúe verificando el bienestar de los ratones, así como las líneas de infusión. Asegúrese de que el tubo de infusión esté correctamente asegurado y que no haya fugas de los puntos de conexión de la línea. Después de que se haya completado la primera infusión, detenga la infusión y coloque una pinza en el tubo del catéter para evitar el reflujo.
Retire suavemente los ratones de sus recintos sin perturbar el catéter para recolectar sangre. Para este experimento, los ratones se sometieron a una punción en la vena de la mejilla utilizando una lanceta de cuatro milímetros. Recolecte aproximadamente 75 microlitros de sangre en el vial deseado.
Para desproteinizar las muestras en preparación para la espectrometría de masas, agregue aproximadamente 15 microlitros de sangre a 500 microlitros de acetona. La sangre restante se puede utilizar para comprobar el nivel de glucosa en sangre a través de glucómetro y / o una centrífuga para separar el plasma para futuros ensayos hormonales. Retire la infusión de las bombas de la jeringa desconectando el tubo de las jeringas y reemplácelo con la segunda infusión que contenga trazador junto con glucosa.
Repita los pasos de perfusión anteriores utilizando la infusión de glucosa isotópica rica en glucosa. Para alcanzar el estado estacionario, ejecute un bolo del segundo infusión a 600 microlitros por hora durante 15 minutos. Tenga en cuenta la hora de inicio para cada grupo de jaulas.
Disminuya la velocidad de infusión a 150 microlitros por hora para completar las tres horas del tiempo total de infusión. Repita la toma de muestras de sangre como se describió anteriormente. Desconecte las infusiones, aplique presión en los sitios del catéter hasta que el sangrado se detenga y devuelva a los ratones a sus jaulas domésticas.
A continuación, las muestras se envían para GCMS. Calcular el enriquecimiento isotópico del isótopo de glucosa bajo pico de glucosa por GCCMS utilizando el derivado pentaacetato. Brevemente, este método implica la preparación del derivado pentaacetato de la glucosa, seguido de un análisis de muestra utilizando GCMS en el modo de ionización química positiva.
Se realiza un monitoreo selectivo de iones de la relación masa-carga, 171 a 169, para determinar el enriquecimiento M más dos del isótopo de glucosa. Todas las mediciones cinéticas se realizan asumiendo condiciones de estado estacionario. Calcular la tasa de aparición total de glucosa plasmática a partir del enriquecimiento M más dos del isótopo de glucosa y el plasma utilizando ecuaciones de dilución de isótopos establecidas.
En condiciones de estado estacionario, se supone que la tasa de aparición de glucosa es igual a la tasa de desaparición de glucosa. La tasa de producción endógena de glucosa es igual a la tasa total de glucosa plasmática menos la glucosa exógena. La primera tabla incluye los resultados representativos del estudio.
Todas las unidades se expresan como miligramo por kilogramo y minuto. Utilizando ecuaciones de dilución de isótopos previamente descritas, se calculó la tasa total de glucosa plasmática. En el grupo de control, la tasa media de aparición de glucosa fue de 19,98 en el estado de ayuno.
En condiciones ricas en glucosa, la tasa de aparición de glucosa fue de 25,8. La tasa de producción de glucosa fue de 19,08 en el estado de ayuno y de 8,56 en el estado rico en glucosa. El metabolismo anormal de la glucosa y la homeostasis son comunes en el SOP.
En los trastornos del metabolismo anormal de la glucosa, la regulación de la supresión de la producción de glucosa se ve comprometida, lo que lleva a la hiperglucemia. En este estudio, describimos una forma sencilla de medir la tasa de producción hepática de glucosa en múltiples ratones al mismo tiempo. Los componentes críticos de este experimento son la inserción del catéter y la definición de las mediciones exactas del isótopo de glucosa y la glucosa natural para realizar adecuadamente GCMS.
Las ventajas del estudio es lograr la infusión de una manera mínimamente invasiva debido a la inserción del catéter de la vena de la cola, así como al uso de un marcador de glucosa estable y fácilmente alcanzable. Hay algunas limitaciones para el estudio, incluida la demanda técnica del procedimiento y la necesidad de posibles habilidades adicionales. En general, describimos una forma sencilla y precisa de medir la tasa de producción total de glucosa hepática en un modelo de ratón con SOP.
Esta técnica podría servir como base para múltiples estudios que involucran el metabolismo de la glucosa de modelos de ratón.
