يساعد هذا البروتوكول على التحليل الكمي لبنية 3D للوصلات العصبية العضلية بدقة قريبة من المجهر الإلكتروني باستخدام إجراء بسيط. الميزة الرئيسية لهذا البروتوكول هي أن عينات العضلات تتم معالجتها بشكل مشابه وموسومة مناعيا للفحص المجهري متحد البؤر و STED ، مما يقلل من الوقت اللازم لتقييم بنية الوصلة العصبية العضلية الدقيقة في النماذج الحيوانية. يمكن تكييف القياس الكمي المورفولوجي الذي طورناه بسهولة لتحليل الهياكل تحت الخلوية الأخرى.
إنه لمن دواعي سروري أن أقدم الدكتورة مارتينا مارينيلو ، عالمة من فريقي ستوضح كيفية إجراء إغاظة العضلات وتلطيخ المناعة وتقديم بعض التوصيات للتطبيق الناجح لهذا البروتوكول. يسعدني أن أقدم الدكتور جيريمي كوزيت من منصة التصوير في Genethon الذي سيعرض الحصول على الصور وتحليلها باستخدام المجاهر متحدة البؤر و STED. بعد القتل الرحيم ، ابدأ في إغاظة عضلات الظنبوب الأمامية في حزم ألياف صغيرة يبلغ عرضها حوالي ملليمتر واحد باستخدام ملقطين مسنين دقيقين.
بعد ذلك ، انقل حزم العضلات هذه إلى صفيحة مكونة من 24 بئرا تحتوي على 1٪ Triton X-100 محضرة في PBS واتركها تهيج بلطف لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة أو خمس ساعات عند أربع درجات مئوية. بعد غسل العينات ثلاث مرات لمدة خمس دقائق باستخدام PBS في درجة حرارة الغرفة ، قم باحتضان العينات بمحلول مانع يتكون من 4٪ BSA محضر في PBS مع 1٪ Triton X-100 لمدة أربع ساعات عند أربع درجات مئوية تحت تحريض لطيف. بعد ذلك ، احتضان العينات طوال الليل بنفس محلول الحجب الذي يحتوي على أجسام مضادة أولية وحيدة النسيلة ضد الخيوط العصبية M أو البروتين السكري الحويصلي المشبكي 2 لتسمية نهايات المحور العصبي قبل المشبكي أو المناطق النشطة ، على التوالي.
في اليوم التالي ، اغسل حزم العضلات المصنفة ثلاث مرات لمدة خمس دقائق باستخدام PBS تحت التحريض اللطيف. بعد ذلك ، احتضنها بأجسام مضادة ثانوية مناسبة عن طريق وضعها على شاكر لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة. بعد غسل حزم العضلات مرة أخرى ، ضعها على شريحة مع وسيط التركيب.
بعد ذلك ، ضع غطاء زجاجي بدرجة 1.5 درجة على الجزء العلوي ، متبوعا بمغناطيس أسطواني على جانبي الشريحة للضغط وتسطيح العضلات. للحصول على الصور باستخدام المجهر متحد البؤر ، قم بتشغيل برنامج المجهر واختر الجهاز كوضع تكوين وجمع أكوام الصور للتقاطعات العصبية العضلية في كل مجموعة تجريبية وفقا للإعدادات المذكورة في مخطوطة النص. في نهاية الجلسة ، انقر فوق فتح في عارض ثلاثي الأبعاد واختر ممثل تقاطع عصبي عضلي لمجموعة تجريبية لتصور وضع العلامات ثلاثية الأبعاد.
لحساب الوصلة العصبية العضلية بعد المشبكي وحجم اللوحة ، ومنطقة إسقاط الكثافة القصوى ، والتعرج النسبي ، اسحب الماكرو وأفلته لتحديد حجم الوصلة العصبية العضلية إلى نافذة Image J ، وعندما يفتح الماكرو في نافذة ثانية ، انقر فوق وحدات الماكرو وتشغيل الماكرو. حدد المجلد الأصلي الذي يحتوي على المجلدات الفرعية للتقاطع المراد تحليلها وانقر فوق تحديد. ثم ، في القائمة المنبثقة لمجلد الحفظ ، حدد مجلد التخزين وانقر فوق تحديد.
في القائمة المنبثقة الجديدة المسماة نوع الصورة، حدد تنسيق عمليات الاستحواذ على مكدس Z. حدد قناة RGB المقابلة لتلطيخ الاهتمام وحدد حجم X و Y بكسل وخطوة Z. إذا تم تحديد تنسيقات ملفات خاصة ، فإن الماكرو يقرأ مباشرة حجم البكسل والخطوة Z.
لتحديد تراكم الخيوط العصبية قبل المشبكي ، اسحب الماكرو وأفلته لتحديد كمية تراكم الوصلة العصبية العضلية إلى نافذة Image J ، وانقر فوق وحدات الماكرو وتشغيل الماكرو. حدد المجلدات الفرعية للوصلة ومجلد التخزين وتنسيق عمليات الاستحواذ على مكدس Z كما هو موضح سابقا. بعد ذلك ، في النافذة المنبثقة Staining Infos ، أشر إلى التسمية واللون قبل المشبكي وما بعد المشبكي وانقر فوق OK.In النافذة المنبثقة Pixel Size ، وحدد حجم البكسل X ، Y على أنه 0.072 ميكرومتر ، والخطوة Z على أنها 0.5 ميكرومتر ، وانقر فوق موافق. إذا تم تحديد تنسيقات ملفات خاصة ، فإن الماكرو يقرأ مباشرة حجم البكسل والخطوة Z.
لحساب المسافة بين خطوط مستقبلات الأسيتيل كولين ، حدد قائمة Quantify أعلى النافذة المركزية. انقر فوق علامة التبويب أدوات ، وحدد الكثافة ، وانقر على أيقونة ملف تعريف الخط. اضبط أخذ العينات الزائدة على واحدة وحدد فرز القنوات.
انقر فوق علامة التبويب Open Projects وحدد الصورة التي تمت تصفيتها ليتم تحليلها. ثم ، انقر فوق رمز خط الرسم وتتبع خطا يتقاطع بشكل عمودي عدة خطوط أو طيات وصلة. انقر فوق الجزء العلوي من القمة الأولى وحرك مؤشر الماوس أثناء الضغط على زر الماوس الأيسر حتى يتم الوصول إلى القمة القصوى التالية.
لاحظ قيمة DX ، والتي تتوافق مع المسافة بين القمتين. انقر بزر الماوس الأيمن على الماوس أثناء وجودك في صورة النافذة اليمنى وحدد حفظ عائد الاستثمار. بعد النقر على أيقونة السهم ، انقر فوق عائد الاستثمار واحذفه بالنقر فوق رمز bin.
لحساب عرض شريط مستقبلات الأسيتيل كولين ، حدد الكثافة في اللوحة العلوية اليسرى ضمن علامة التبويب الأدوات ، وانقر فوق رمز تحديد FWHM ، وحدد قنوات الفرز. ثم انقر فوق علامة التبويب فتح المشاريع وحدد الصورة التي تمت تصفيتها ليتم تحليلها. بعد ذلك ، انقر فوق رمز رسم المستطيل في القائمة العلوية للنافذة اليمنى.
حدد شريطا أفقيا أو رأسيا وارسم مستطيلا بشكل عمودي على الشريط. يظهر ملف تعريف في النافذة المركزية. انقر فوق رأسي أو أفقي من قائمة متوسط العرض الموجودة في اللوحة اليمنى ، اعتمادا على ما إذا كان اتجاه الشريط رأسيا أو أفقيا.
انقر فوق الإحصائيات في النافذة المركزية لقراءة قيمة FWHM ثم احفظ وحذف عائد الاستثمار كما هو موضح سابقا. بدت لوحة نهاية المحرك بعد المشبكي ، الموسومة ب alpha-Bungarotoxin الفلورية ، أصغر حجما ومجزأة في طفرات خطين من الفئران. كشف القياس الكمي لمداخن الوصلة العصبية العضلية Z باستخدام وحدات ماكرو Image J المخصصة عن انخفاض ملحوظ في حجم اللوحة الطرفية ، وإسقاط الكثافة القصوى ، والتعرج النسبي في كلا نموذجي فأر المرض مقارنة بعناصر التحكم ، مما يشير إلى عيوب نضج الوصلة العصبية العضلية.
كشف القياس الكمي لتوزيع فرع المحور المحوري قبل المشبكي باستخدام الماكرو المخصص Image J عن نمط متغير في توزيع الخيوط العصبية M في النموذجين الحيوانيين مع زيادة وضع العلامات المناعية. من خلال تلطيخ البروتين السكري الحويصلي المشبكي 2 ، لوحظ انخفاض بنسبة 43٪ في نسبة إشغال المناطق المحتوية على مستقبلات الأسيتيل كولين مع المناطق النشطة الطرفية العصبية المجاورة في Smn 2B / الفئران. تم تصور جانب لوحات نهاية ما بعد المشبكي للوصلة العصبية العضلية بوضوح من خلال وضع العلامات على السموم الفلورية ألفا بونجاروتوكسين وتحليل ملف تعريف الشدة.
كشف تقييم معلمات الوصلة العصبية العضلية عن زيادة في مسافة الطيات الموصلة وعرض خطوط مستقبلات الأسيتيل كولين في عضلة الساق للمتحولات. للحصول على نتائج موثوقة ، من الضروري ندف العضلات بشكل صحيح ، مع إيلاء اهتمام خاص للقوة المطبقة لفصل حزم العضلات. يمكن أن يساعد هذا البروتوكول في الحصول على توصيف مورفولوجي أكثر تعمقا للوصلة العصبية العضلية ، والتي كانت تحسب في السابق فقط من خلال إجراءات معقدة وتستغرق وقتا طويلا ، مثل المجهر الإلكتروني النافذ.
مهد إجراء التصوير STED الطريق للتحقيق في رؤى جديدة تتعلق بعلامات ما قبل وبعد المشبكي ، والتي تساهم في الفيزيولوجيا المرضية للأمراض التي تؤثر على الموصل العصبي العضلي.
