פרוטוקול זה מסייע לנתח באופן כמותי את המבנה התלת-ממדי של צמתים עצביים-שריריים ברזולוציה הקרובה למיקרוסקופיית אלקטרונים באמצעות הליך פשוט. היתרון העיקרי של פרוטוקול זה הוא שדגימות שרירים מעובדות באופן דומה ומאושרות באופן חיסוני עבור מיקרוסקופיה קונפוקלית ו-STED, מה שמקצר את הזמן להערכה מדויקת של מבנה הצומת העצבי-שרירי במודלים של בעלי חיים. ניתן להתאים בקלות את הכימות המורפולוגי שפיתחנו כדי לנתח מבנים תת-תאיים אחרים.
אני שמח להציג את ד"ר מרטינה מרינלו, מדענית מהצוות שלי שתראה כיצד מבוצעים הקנטות שרירים וכתמי חיסון ותיתן כמה המלצות ליישום מוצלח של פרוטוקול זה. אני שמח להציג את ד"ר ג'רמי קוזט מפלטפורמת ההדמיה של ג'נתון שיציג רכישה וניתוח של תמונות באמצעות מיקרוסקופים קונפוקליים ו-STED. לאחר המתת חסד, מתחילים להקניט את השרירים הקדמיים של הטיביאליס בצרורות סיבים קטנים ברוחב של כמילימטר אחד באמצעות שני מלקחיים משוננים עדינים.
לאחר מכן, העבירו את צרורות השרירים הללו לצלחת בת 24 בארות המכילה 1% Triton X-100 שהוכנה ב-PBS ואפשרו לה להתסיס בעדינות במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר או חמש שעות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר שטיפת הדגימות שלוש פעמים במשך חמש דקות עם PBS בטמפרטורת החדר, דגירה של הדגימות עם תמיסת חסימה המורכבת מ-4% BSA שהוכנה ב-PBS עם 1% Triton X-100 למשך ארבע שעות בארבע מעלות צלזיוס תחת תסיסה עדינה. לאחר מכן, דגרו את הדגימות למשך הלילה עם אותה תמיסת חסימה המכילה נוגדנים חד-שבטיים ראשוניים נגד נוירופילמנט M או גליקופרוטאין שלפוחית סינפטית 2 כדי לסמן מסופי אקסון קדם-סינפטיים או אזורים פעילים, בהתאמה.
למחרת, יש לשטוף את צרורות השרירים המסומנים שלוש פעמים במשך חמש דקות עם PBS תחת תסיסה עדינה. לאחר מכן, לדגור אותם עם נוגדנים משניים מתאימים על ידי הנחתם על שייקר במשך שעתיים בטמפרטורת החדר. לאחר שטיפת צרורות השרירים שוב, מניחים אותם על מגלשה עם מדיום הרכבה.
לאחר מכן, הניחו מכסה זכוכית בדרגה 1.5 על החלק העליון, ולאחר מכן מגנטים גליליים משני צידי המגלשה כדי להפעיל לחץ ולשטח את השרירים. כדי לרכוש תמונות באמצעות המיקרוסקופ הקונפוקלי, הפעל את תוכנת המיקרוסקופ ובחר מכונה כמצב תצורה ואסוף ערימות תמונות של הצמתים העצביים-שריריים בכל קבוצת ניסוי בהתאם להגדרות המוזכרות בכתב היד של הטקסט. בסוף המפגש, לחץ על פתח במציג תלת מימד ובחר צומת נוירומוסקולרי המייצג קבוצת ניסוי כדי לדמיין את התיוג התלת-ממדי.
כדי לחשב את הצומת העצבי-שרירי הפוסט-סינפטי ואת נפח הצלחת, את שטח ההקרנה בעוצמה מרבית ואת הטורטואוזיות היחסית, גרור ושחרר את המאקרו לכימות נפח הצומת העצבי-שרירי לחלון Image J, וכאשר המאקרו נפתח בחלון שני, לחץ על פקודות מאקרו והפעל מאקרו. בחר את התיקייה המקורית המכילה את תיקיות המשנה של הצומת לניתוח ולחץ על בחר. לאחר מכן, בתפריט הקופץ של תיקיית השמירה, בחר את תיקיית האחסון ולחץ על בחר.
בתפריט הנפתח החדש שנקרא Image Type, בחר בתבנית של רכישות מחסנית Z. בחר בערוץ RGB המתאים לצביעת העניין וציין X, Y גודל פיקסלים ושלב Z. אם נבחרו תבניות קובץ קנייניות, המאקרו יקרא ישירות את גודל הפיקסלים ואת שלב Z.
כדי לכמת הצטברות נוירופילמנט קדם-סינפטית, גרור ושחרר את המאקרו לכימות הצטברות צומת עצבי-שרירי לחלון תמונה J, ולחץ על פקודות מאקרו והפעל מאקרו. בחר את תיקיות המשנה של הצומת, תיקיית האחסון ואת התבנית של רכישות מחסנית Z כפי שהוכח קודם לכן. לאחר מכן, בחלון הקופץ Staining Infos, ציין את התווית והצבע הקדם-סינפטיים והפוסט-סינפטיים ולחץ על OK.In החלון הקופץ גודל פיקסל, ציין את גודל הפיקסל X, Y כ- 0.072 מיקרומטר, שלב Z כ- 0.5 מיקרומטר ולחץ על אישור. אם נבחרו תבניות קובץ קנייניות, המאקרו יקרא ישירות את גודל הפיקסלים ואת שלב Z.
כדי לחשב את המרחק בין פסי הקולטן אצטילכולין, בחר בתפריט כימות מעל החלון המרכזי. לחץ על הכרטיסייה כלים, בחר עוצמה ולחץ על סמל פרופיל הקו. הגדר דגימת יתר לאחד וסמן את מיין ערוצים.
לחץ על הכרטיסייה פתח פרויקטים ובחר את התמונה המסוננת לניתוח. לאחר מכן, לחץ על סמל קו הציור ועקוב אחר קו חוצה בניצב מספר פסים או קיפולים צומתיים. לחץ על החלק העליון של השיא הראשון והזז את מצביע העכבר תוך כדי לחיצה על לחצן העכבר השמאלי עד להגעה לשיא המרבי הבא.
שים לב לערך DX, המתאים למרחק בין שתי הפסגות. לחץ לחיצה ימנית על העכבר כאשר בתמונה של החלון הימני ובחר שמור ROIs. לאחר לחיצה על סמל החץ, לחץ על החזר ההשקעה ומחק אותו על ידי לחיצה על סמל הפח.
לחישוב רוחב פס הקולטן אצטילכולין, בחר עוצמה בחלונית השמאלית העליונה מתחת לכרטיסייה כלים, לחץ על הסמל קבע FWHM וסמן את ערוצי המיון. לאחר מכן לחץ על פתח פרויקטים הכרטיסייה ובחר את התמונה המסוננת לניתוח. לאחר מכן, לחץ על סמל מלבן הציור בתפריט העליון של החלון הימני.
בחר פס אופקי או אנכי וצייר מלבן בניצב לפס. פרופיל מופיע בחלון המרכזי. לחץ על אנכי או אופקי בתפריט 'הקרנה ממוצעת' הממוקם בחלונית השמאלית, בהתאם לכיוון הפס או לאופקי.
לחץ על סטטיסטיקה בחלון המרכזי כדי לקרוא את הערך FWHM ולאחר מכן שמור ומחק את ה- ROIs כפי שהודגם קודם לכן. לוחית הקצה המוטורית הפוסט-סינפטית, המסומנת באלפא-בונגארוטוקסין פלואורסצנטית, נראתה קטנה יותר ומקוטעת במוטנטים של שני קווי עכבר. כימות ערימות הצומת העצבי-שרירי Z באמצעות פקודות המאקרו המותאמות אישית של Image J חשף ירידה ניכרת בנפח לוח הקצה, הקרנה בעוצמה מרבית וטורטואוזיות יחסית בשני המודלים של עכברי מחלה בהשוואה לפקדים, מה שמעיד על פגמים בהבשלה של צומת נוירומוסקולרי.
כימות התפלגות הענפים הטרמינליים של האקסון הקדם-סינפטי באמצעות המאקרו המותאם אישית Image J חשף שינוי בהתפלגות הנוירופילמנט M בשני המודלים החייתיים עם תיוג חיסוני מוגבר. באמצעות צביעת גליקופרוטאין 2 שלפוחית סינפטית, נצפתה ירידה של 43% ביחס התפוסה של האזורים המכילים קולטן אצטילכולין עם אזורים פעילים סמוכים של מסוף העצבים ב- Smn 2B / עכברים. ההיבט של לוחות הקצה הפוסט-סינפטיים של הצומת העצבי-שרירי הודגם בבירור על ידי תיוג אלפא-בונגארוטוקסין פלואורסצנטי וניתוח פרופיל עוצמה.
הערכת הפרמטרים של הצומת העצבי-שרירי גילתה עלייה במרחק הקפל הצומתי וברוחב של פסי קולטן אצטילכולין בשריר הגסטרוקנמיוס של המוטנטים. כדי להשיג תוצאות אמינות, חיוני להקניט את השרירים כראוי, תוך מתן תשומת לב מיוחדת לכוח המופעל כדי להפריד בין צרורות שרירים. פרוטוקול זה יכול לסייע בהשגת אפיון מורפולוגי מעמיק יותר של צומת נוירומוסקולרי, שבעבר הובא בחשבון רק על ידי הליכים מורכבים וגוזלי זמן, כגון מיקרוסקופיית אלקטרונים הולכה.
הליך הדמיית STED סלל את הדרך לחקר תובנות חדשות בנוגע לסמנים טרום-סינפטיים ופוסט-סינפטיים, התורמים לפתופיזיולוגיה של מחלות המשפיעות על צומת עצבי-שרירי.
