Bu protokol, basit bir prosedür kullanarak nöromüsküler kavşakların 3D yapısını elektron mikroskobuna yakın bir çözünürlükte nicel olarak analiz etmeye yardımcı olur. Bu protokolün temel avantajı, kas örneklerinin benzer şekilde işlenmesi ve konfokal ve STED mikroskopisi için immüno-etiketli olmasıdır, bu da hayvan modellerinde doğru nöromüsküler kavşak yapısı değerlendirmesi için zamanı azaltır. Geliştirdiğimiz morfolojik niceleme, diğer hücre altı yapıları analiz etmek için kolayca uyarlanabilir.
Kas alaycılığı ve immün boyamaların nasıl yapıldığını gösterecek ve bu protokolün başarılı bir şekilde uygulanması için bazı önerilerde bulunacak olan ekibimden bir bilim adamı olan Dr. Martina Marinello'yu tanıtmaktan mutluluk duyuyorum. Genethon'un görüntüleme platformundan Dr. Jeremie Cosette'i tanıtmaktan mutluluk duyuyorum, o da konfokal ve STED mikroskopları kullanarak görüntü toplama ve analiz gösterecek. Ötanizasyon sonrası, iki ince tırtıklı forseps kullanarak tibialis anterior kaslarını yaklaşık bir milimetre genişliğindeki küçük lif demetlerinde alay etmeye başlayın.
Daha sonra, bu kas demetlerini PBS'de hazırlanan% 1 Triton X-100 içeren 24 delikli bir plakaya aktarın ve oda sıcaklığında bir saat veya dört santigrat derecede beş saat boyunca hafifçe çalkalanmasını sağlayın. Numuneleri oda sıcaklığında PBS ile beş dakika boyunca üç kez yıkadıktan sonra, numuneleri PBS'de hazırlanan% 4 BSA'dan oluşan bir blokaj çözeltisi ile% 1 Triton X-100 ile dört saat boyunca dört santigrat derecede hafif ajitasyon altında inkübe edin. Daha sonra, sırasıyla presinaptik akson terminallerini veya aktif bölgeleri etiketlemek için numuneleri nörofilament M veya sinaptik vezikül glikoprotein 2'ye karşı birincil monoklonal antikorlar içeren aynı bloke edici çözelti ile gece boyunca inkübe edin.
Ertesi gün, etiketli kas demetlerini hafif ajitasyon altında PBS ile beş dakika boyunca üç kez yıkayın. Daha sonra, oda sıcaklığında iki saat boyunca bir çalkalayıcıya yerleştirerek uygun ikincil antikorlarla inkübe edin. Kas demetlerini tekrar yıkadıktan sonra, montaj ortamına sahip bir slayta yerleştirin.
Ardından, üstüne 1,5 dereceli bir cam kapak kayması, ardından basınç uygulamak ve kasları düzleştirmek için slaytın her iki tarafına silindirik mıknatıslar yerleştirin. Konfokal mikroskobu kullanarak görüntü elde etmek için, mikroskop yazılımını başlatın ve yapılandırma modu olarak makineyi seçin ve metin yazısında belirtilen ayarlara göre her deney grubundaki nöromüsküler kavşakların görüntü yığınlarını toplayın. Oturumun sonunda, 3B görüntüleyicide aç'a tıklayın ve 3B etiketlemeyi görselleştirmek için bir deney grubunun nöromüsküler kavşak temsilcisini seçin.
Sinaptik sonrası nöromüsküler bağlantı ve plaka hacmini, maksimum yoğunluk projeksiyon alanını ve göreceli kıvrımlılığı hesaplamak için, nöromüsküler birleşim hacmi ölçümü için makroyu sürükleyip Görüntü J penceresine bırakın ve makro ikinci bir pencerede açıldığında, Makrolar ve Makroyu çalıştır'a tıklayın. Analiz edilecek birleşim alt klasörlerini içeren yerel klasörü seçin ve Seç'e tıklayın. Ardından, kaydetme klasörü açılır menüsünde, depolama klasörünü seçin ve Seç'e tıklayın.
Görüntü Türü adlı yeni açılır menüde, Z yığını alımlarının biçimini seçin. İlgilenilen lekelenmeye karşılık gelen RGB kanalını seçin ve X, Y piksel boyutu ve Z adımını belirtin. Özel dosya biçimleri seçilirse, makro doğrudan piksel boyutunu ve Z adımını okur.
Presinaptik nörofilament birikimini ölçmek için, nöromüsküler birleşim birikimi niceliği için makroyu sürükleyip Görüntü J penceresine bırakın ve Makrolar ve Makroyu çalıştır'a tıklayın. Daha önce gösterildiği gibi birleşim alt klasörlerini, depolama klasörünü ve Z yığını alımlarının biçimini seçin. Ardından, Boyama Bilgileri açılır penceresinde, sinaptik öncesi ve sonrası sinaptik etiketi ve rengi belirtin ve Piksel Boyutu açılır penceresini OK.In tıklayın, X, Y piksel boyutunu 0,072 mikrometre olarak, Z adımını 0,5 mikrometre olarak belirtin ve Tamam'ı tıklayın. Özel dosya biçimleri seçilirse, makro doğrudan piksel boyutunu ve Z adımını okur.
Asetilkolin reseptör şeritleri arasındaki mesafeyi hesaplamak için, merkezi pencerenin üstündeki Nicelik menüsünü seçin. Araçlar sekmesine tıklayın, yoğunluğu seçin ve çizgi profili simgesine tıklayın. Aşırı örneklemeyi bir taneye ayarlayın ve Kanalları Sırala'yı işaretleyin.
Projeleri Aç sekmesine tıklayın ve analiz edilecek filtrelenmiş görüntüyü seçin. Ardından, çizgi çiz simgesini tıklatın ve dikey olarak birkaç çizgiyi veya birleşim kıvrımlarını kesen bir çizgiyi izleyin. İlk tepe noktasının üstüne tıklayın ve bir sonraki maksimum tepe noktasına ulaşılana kadar farenin sol düğmesine basarken fare işaretçisini hareket ettirin.
İki tepe noktası arasındaki mesafeye karşılık gelen DX değerine dikkat edin. Sağ pencerenin görüntüsündeyken fareye sağ tıklayın ve YG'leri Kaydet'i seçin. Ok simgesine tıkladıktan sonra, YG'ye tıklayın ve bin simgesine tıklayarak silin.
Asetilkolin reseptör şeridinin genişliğini hesaplamak için, araçlar sekmesinin altındaki sol üst panelde yoğunluğu seçin, FWHM'yi belirle simgesine tıklayın ve sıralama kanallarını işaretleyin. Ardından Projeleri Aç sekmesine tıklayın ve analiz edilecek filtrelenmiş görüntüyü seçin. Ardından, sağ pencerenin üst menüsündeki dikdörtgen çiz simgesine tıklayın.
Yatay veya dikey bir şerit seçin ve şeride dik olarak bir dikdörtgen çizin. Orta pencerede bir profil görünür. Sol panelde bulunan Ortalama Projeksiyon menüsünün dikey veya yatay olmasına bağlı olarak, şerit yönünün dikey veya yatay olmasına bağlı olarak tıklayın.
FWHM değerini okumak için orta penceredeki İstatistikler'e tıklayın ve ardından YG'leri daha önce gösterildiği gibi kaydedin ve silin. Floresan alfa-Bungarotoksin ile etiketlenmiş post-sinaptik motor uç plakası, iki fare çizgisinin mutantlarında daha küçük ve parçalanmış görünüyordu. Özelleştirilmiş Image J makroları kullanılarak nöromüsküler bileşke Z yığınlarının nicelleştirilmesi, her iki hastalık fare modelinde kontrollere kıyasla uç plaka hacminde, maksimum yoğunluk projeksiyonunda ve göreceli kıvrımda belirgin bir azalma olduğunu ortaya koymuştur ve nöromüsküler kavşak olgunlaşma kusurlarını göstermektedir.
Image J özel makrosu kullanılarak presinaptik akson terminal dal dağılımının ölçülmesi, immünoetiketlemenin arttığı iki hayvan modelinde nörofilament M dağılımında değişmiş bir model ortaya çıkardı. Sinaptik vezikül glikoprotein 2 boyama yoluyla, Smn 2B / farelerde bitişik sinir terminali aktif bölgeleri olan asetilkolin reseptörü içeren bölgelerin doluluk oranında% 43'lük bir azalma gözlenmiştir. Nöromüsküler bileşke sonrası sinaptik uç plakalarının yönü, floresan alfa-Bungarotoksin etiketlemesi ve yoğunluk profili analizi ile açıkça görselleştirildi.
Nöromüsküler bileşke parametrelerinin değerlendirilmesi, mutantların gastroknemius kasındaki asetilkolin reseptör şeritlerinin bileşke mesafesi ve genişliğinde bir artış olduğunu ortaya koydu. Güvenilir sonuçlar elde etmek için, kasları düzgün bir şekilde kızdırmak, kas demetlerini ayırmak için uygulanan güce özellikle dikkat etmek çok önemlidir. Bu protokol, daha önce sadece iletim elektron mikroskobu gibi karmaşık ve zaman alıcı prosedürlerle açıklanan nöromüsküler kavşağın daha derinlemesine morfolojik karakterizasyonunun elde edilmesine yardımcı olabilir.
STED görüntüleme prosedürü, nöromüsküler kavşağı etkileyen hastalıkların patofizyolojisine katkıda bulunan sinaptik öncesi ve sonrası belirteçlerle ilgili yeni anlayışların araştırılmasının yolunu açmıştır.
