Questo protocollo aiuta ad analizzare quantitativamente la struttura 3D delle giunzioni neuromuscolari con una risoluzione vicina alla microscopia elettronica utilizzando una semplice procedura. Il vantaggio principale di questo protocollo è che i campioni muscolari vengono elaborati in modo simile e immunomarcati per la microscopia confocale e STED, riducendo il tempo per un'accurata valutazione della struttura della giunzione neuromuscolare nei modelli animali. La quantificazione morfologica che abbiamo sviluppato può essere facilmente adattata per analizzare altre strutture subcellulari.
Ho il piacere di presentarvi la dottoressa Martina Marinello, una scienziata del mio team che mostrerà come vengono eseguite le prese in giro muscolari e le immunocolorazioni e darà alcune raccomandazioni per l'applicazione di successo di questo protocollo. Sono lieto di presentare il Dr.Jeremie Cosette della piattaforma di imaging di Genethon che mostrerà l'acquisizione e l'analisi delle immagini utilizzando microscopi confocali e STED. Dopo l'eutanasia, iniziare a stuzzicare i muscoli tibiali anteriori in piccoli fasci di fibre larghi circa un millimetro usando due pinze seghettate sottili.
Quindi, trasferire questi fasci muscolari in una piastra a 24 pozzetti contenente 1% Triton X-100 preparato in PBS e lasciarlo agitare delicatamente per un'ora a temperatura ambiente o cinque ore a quattro gradi Celsius. Dopo aver lavato i campioni tre volte per cinque minuti con PBS a temperatura ambiente, incubare i campioni con una soluzione bloccante composta da 4% BSA preparata in PBS con 1% Triton X-100 per quattro ore a quattro gradi Celsius sotto delicata agitazione. Quindi, incubare i campioni durante la notte con la stessa soluzione bloccante contenente anticorpi monoclonali primari contro il neurofilamento M o la glicoproteina 2 della vescicola sinaptica per marcare rispettivamente i terminali degli assoni presinaptici o le zone attive.
Il giorno seguente, lavare i fasci muscolari etichettati tre volte per cinque minuti con PBS sotto delicata agitazione. Quindi, incubarli con anticorpi secondari appropriati mettendoli su uno shaker per due ore a temperatura ambiente. Dopo aver lavato nuovamente i fasci muscolari, posizionarli su un vetrino con mezzo di montaggio.
Quindi, posizionare una linguetta di copertura in vetro di grado 1,5 sulla parte superiore, seguita da magneti cilindrici su entrambi i lati della diapositiva per applicare pressione e appiattire i muscoli. Per acquisire immagini utilizzando il microscopio confocale, avviare il software del microscopio e scegliere la macchina come modalità di configurazione e raccogliere pile di immagini delle giunzioni neuromuscolari in ciascun gruppo sperimentale secondo le impostazioni menzionate nel manoscritto di testo. Al termine della sessione, cliccare su Apri in visualizzatore 3D e scegliere una giunzione neuromuscolare rappresentativa di un gruppo sperimentale per visualizzare l'etichettatura 3D.
Per calcolare la giunzione neuromuscolare post-sinaptica e il volume della piastra, l'area di proiezione della massima intensità e la tortuosità relativa, trascinare e rilasciare la macro per la quantificazione del volume della giunzione neuromuscolare nella finestra Immagine J e, quando la macro si apre in una seconda finestra, fare clic su Macro ed esegui macro. Selezionare la cartella nativa contenente le sottocartelle di giunzione da analizzare e cliccare su Seleziona. Quindi, nel menu a comparsa della cartella di salvataggio, selezionare la cartella di archiviazione e fare clic su Seleziona.
Nel nuovo menu a comparsa chiamato Tipo immagine, seleziona il formato delle acquisizioni dello stack Z. Selezionare il canale RGB corrispondente alla colorazione di interesse e indicare X, dimensione pixel Y e passo Z. Se sono selezionati formati di file proprietari, la macro legge direttamente la dimensione dei pixel e il passo Z.
Per quantificare l'accumulo di neurofilamenti presinaptici, trascinare e rilasciare la macro per la quantificazione dell'accumulo della giunzione neuromuscolare nella finestra Immagine J e fare clic su Macro e Esegui macro. Selezionare le sottocartelle di giunzione, la cartella di archiviazione e il formato delle acquisizioni dello stack Z, come illustrato in precedenza. Quindi, nel popup Informazioni sulla colorazione, indica l'etichetta e il colore pre-sinaptico e post-sinaptico e fai clic su OK.In popup Dimensione pixel, indica la dimensione X, Y pixel come 0,072 micrometri, il passo Z come 0,5 micrometri e fai clic su OK. Se sono selezionati formati di file proprietari, la macro legge direttamente la dimensione dei pixel e il passo Z.
Per calcolare la distanza tra le strisce del recettore dell'acetilcolina, selezionare il menu Quantifica nella parte superiore della finestra centrale. Fare clic sulla scheda Strumenti, selezionare l'intensità e fare clic sull'icona del profilo della linea. Imposta Oversampling su uno e seleziona Ordina canali.
Fare clic sulla scheda Apri progetti e selezionare l'immagine filtrata da analizzare. Quindi, fai clic sull'icona della linea di disegno e traccia una linea che attraversa perpendicolarmente diverse strisce o pieghe giunzionali. Fare clic sulla parte superiore del primo picco e spostare il puntatore del mouse mentre si preme il pulsante sinistro del mouse fino a raggiungere il picco massimo successivo.
Notate il valore DX, che corrisponde alla distanza tra i due picchi. Fare clic con il pulsante destro del mouse mentre si è nell'immagine della finestra di destra e selezionare Salva ROI. Dopo aver fatto clic sull'icona della freccia, fai clic sul ROI ed eliminalo facendo clic sull'icona del cestino.
Per calcolare la larghezza della striscia del recettore dell'acetilcolina, selezionare l'intensità nel pannello in alto a sinistra sotto la scheda strumenti, fare clic sull'icona determina FWHM e selezionare i canali di ordinamento. Clicca quindi sulla scheda Apri Progetti e seleziona l'immagine filtrata da analizzare. Quindi, fai clic sull'icona del rettangolo di disegno nel menu in alto della finestra di destra.
Selezionare una striscia orizzontale o verticale e disegnare un rettangolo perpendicolarmente alla striscia. Nella finestra centrale viene visualizzato un profilo. Fare clic su verticale o orizzontale del menu Proiezione media situato nel pannello di sinistra, a seconda che l'orientamento della striscia sia verticale o orizzontale.
Fare clic su Statistiche nella finestra centrale per leggere il valore FWHM e quindi salvare ed eliminare i ROI come dimostrato in precedenza. La piastra terminale del motore post-sinaptico, marcata con alfa-bungarotoxina fluorescente, appariva più piccola e frammentata nei mutanti di due linee di topo. La quantificazione delle pile Z della giunzione neuromuscolare utilizzando le macro personalizzate Image J ha rivelato una marcata diminuzione del volume della piastra terminale, della proiezione di massima intensità e della tortuosità relativa in entrambi i modelli murini di malattia rispetto ai controlli, indicando difetti di maturazione della giunzione neuromuscolare.
La quantificazione della distribuzione del ramo terminale dell'assone presinaptico utilizzando la macro personalizzata Image J ha rivelato un modello alterato nella distribuzione del neurofilamento M nei due modelli animali con un aumento dell'immunomarcatura. Attraverso la colorazione della glicoproteina 2 della vescicola sinaptica, è stata osservata una riduzione del 43% del rapporto di occupazione delle regioni contenenti il recettore dell'acetilcolina con zone attive adiacenti del terminale nervoso nei topi Smn 2B. L'aspetto delle piastre terminali postsinaptiche della giunzione neuromuscolare è stato chiaramente visualizzato mediante marcatura fluorescente di alfa-bungarotoxin e analisi del profilo di intensità.
La valutazione dei parametri della giunzione neuromuscolare ha rivelato un aumento della distanza della piega giunzionale e della larghezza delle strisce del recettore dell'acetilcolina nel muscolo gastrocnemio dei mutanti. Per ottenere risultati affidabili, è fondamentale stuzzicare correttamente i muscoli, prestando particolare attenzione alla forza applicata per separare i fasci muscolari. Questo protocollo può aiutare a ottenere una caratterizzazione morfologica più approfondita della giunzione neuromuscolare, che in precedenza era spiegata solo da procedure complesse e dispendiose in termini di tempo, come la microscopia elettronica a trasmissione.
La procedura di imaging STED ha aperto la strada allo studio di nuove intuizioni riguardanti i marcatori pre e post-sinaptici, che contribuiscono alla fisiopatologia delle malattie che colpiscono la giunzione neuromuscolare.
