يستخدم هذا البروتوكول الأتمتة لإجراء مستحضرات الكيمياء الحيوية للبروتين قبل تجارب قياس الطيف الكتلي ، مما يسمح بإنتاجية أعلى وتباين أقل للدراسات البروتينية. يستخدم هذا البروتوكول نظام مناولة سائل منخفض التكلفة وقابل للبرمجة بأسعار معقولة لعدد أكبر من المختبرات. نحن نقدم نصوص Python مفتوحة المصدر يمكن تعديلها لمزيد من التطوير.
سيكون عرض الإجراء هو ميلتون أمايا ، طالب الماجستير في مختبرنا. للبدء، افتح noSP3_Digestion. البرنامج النصي PY في محرر النصوص وتحديد المتغيرات الخاصة بالتجربة حسب الحاجة في القسم تخصيص هنا فقط.
بعد ذلك، افتح تطبيق Opentrons وقم بتحميل البرنامج النصي إلى علامة التبويب البروتوكول في تطبيق Opentrons. بعد ذلك ، ضع البرامج المختبرية والماصات المطلوبة في الموقع المقابل في سطح OT2 المحدد في البرنامج النصي Python. ثم ضع محلول بيكربونات الأمونيوم في بئر A1 من رف الأنبوب أربعة في واحد مع سطح حامل الأنبوب 15 ملليلتر بالإضافة إلى 50 ملليلتر وضع عينة البروتين في بئر A1 من رف الأنبوب أربعة في واحد مع قمة حامل أنبوب مليلترين.
ضع يدويا أنابيب البروتين منخفضة الارتباط التي يبلغ طولها مليلترين في آبار كتلة الألومنيوم الموضوعة أعلى وحدة درجة الحرارة ، بدءا من A1 والانتقال إلى الأسفل عموديا. ثم ضع محلول DTT في بئر A6 من رف الأنبوب أربعة في واحد مع قمة حامل أنبوب سعة 2 ملليلتر. لاحظ بينما ينقل الروبوت حجما مناسبا من المخزن المؤقت لبيكربونات الأمونيوم إلى أنابيب العينة في كتلة الألومنيوم.
بعد ذلك ، تحقق يدويا من إيقاف برنامج الروبوت مؤقتا وعرض الرسالة ، تأكد من تحميل DTT في A6 من حامل الأنبوب سعة 2 ملليلتر الموجود في الفتحة الرابعة قبل استئناف البروتوكول. بعد التأكد من موقع أنبوب DTT وفتح غطاء الأنبوب ، انقر فوق الزر استئناف في تطبيق Opentrons للمتابعة. تأكد من أن الروبوت ينقل 10 ميكرولترات من محلول DTT إلى كل عينة بشكل جيد ، تليها خمس جولات خلط.
بعد ذلك ، تحقق من إيقاف برنامج الروبوت مؤقتا ويعرض الرسالة ، تأكد من إغلاق الأحرف الكبيرة على أنابيب العينة. ثم ، أغلق أغطية الأنابيب يدويا وانقر فوق استئناف للمتابعة. انتظر حتى تبدأ وحدة درجة حرارة الروبوت في تسخين كتلة الألومنيوم وتصل درجة الحرارة إلى 55 درجة مئوية ، تليها حضانة لمدة خمس دقائق للسماح للعينات بالوصول إلى 55 درجة مئوية.
سيقوم الروبوت بعد ذلك بالاحتفاظ بدرجة الحرارة هذه لمدة 30 دقيقة للسماح بتقليل البروتين بواسطة DTT. أثناء الحضانة ، قم بإعداد محلول يودواسيتاميد ولفه يدويا بورق الألومنيوم لتجنب التعرض للضوء. بعد الحضانة ، عندما يتم إيقاف برنامج الروبوت مؤقتا ويعرض رسالة التحذير ، تأكد من فتح الأحرف الكبيرة على أنابيب العينة ، وقم بإلغاء تغليف أنابيب العينة وانقر فوق استئناف للمتابعة.
بعد ذلك ، تحقق يدويا من إيقاف برنامج الروبوت مؤقتا مع رسالة التحذير ، تأكد من تحميل يودواسيتاميد في B6 من رف الأنبوب المكون من مليلترين الموجود في الفتحة الرابعة قبل استئناف البروتوكول. بعد التأكد من موقع حامل أنبوب يودواسيتاميد وفتح غطاء الأنبوب ، انقر فوق استئناف وتأكد من أن الروبوت ينقل 10 ميكرولترات من محلول يودواسيتاميد إلى كل أنبوب عينة ، تليها خمس جولات خلط. عندما يتم إيقاف برنامج الروبوت مؤقتا وعرض الرسالة ، أغلق الأغطية على أنابيب العينة ، وقم بتغطية أنابيب العينة وتغطيتها بورق ، ثم قم بتغطية كتلة الألومنيوم بأكملها بقطعة نظيفة من الرقائق وانقر فوق استئناف للمتابعة.
انتظر حتى يتم تحضين العينات عند 22 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ، وتأكد من تعطيل وحدة درجة حرارة الروبوت عند الانتهاء من حضانة يودواسيتاميد. عندما يتم إيقاف برنامج الروبوت مؤقتا ويعرض رسالة التحذير ، تأكد من تحميل التربسين في C6 من رف الأنبوب ثنائي الملليلتر الموجود في الفتحة الرابعة قبل استئناف البروتوكول ، ضع محلول التربسين في بئر C6 من رف الأنبوب ثنائي الملليلتر مع فتح غطاء الأنبوب ، وانقر فوق استئناف للمتابعة. بعد ذلك ، عندما يتم إيقاف برنامج الروبوت مؤقتا ويعرض رسالة التحذير ، افتح الأحرف الكبيرة على أنابيب العينة في وحدة درجة الحرارة ، وقم بفك غطاء أنابيب العينة وانقر فوق استئناف للمتابعة.
في وضع الاستعداد بينما ينقل الروبوت 10 ميكرولترات من التربسين إلى كل أنبوب عينة ، تليها خمس جولات خلط. بعد هضم التربسين بين عشية وضحاها ، قم بتدوير العينات لفترة وجيزة باستخدام جهاز طرد مركزي صغير على الطاولة ووضع العينات على رف أنبوب مغناطيسي. بعد دقيقتين ، انقل السوبرناتانت بعناية باستخدام ماصة إلى مجموعة جديدة من أنابيب الطرد المركزي الدقيق منخفضة الارتباط بالبروتين ، واحتفظ بالعينات في الثلاجة.
بعد ذلك ، افتح SP3_peptide_cleanup. py Python script في محرر نصوص ، وحدد متغيرات التجربة حسب الحاجة في قسم تخصيص هنا فقط. بعد ذلك، قم بتحميل البرنامج النصي إلى علامة التبويب البروتوكول في تطبيق Opentrons.
ضع البرامج المختبرية والماصات المطلوبة في الموقع المقابل في سطح OT2 المحدد في برنامج Python النصي ، وتأكد من تشغيل الوحدة المغناطيسية وتوصيلها بالروبوت. ضع صفيحة بئر جديدة بعمق 96 ملليلتر في الجزء العلوي من الوحدة المغناطيسية. بعد ذلك ، ضع العينات المهضومة في رف الأنبوب المكون من مليلترين بدءا من A1 والانتقال لأسفل عموديا.
بعد ذلك ، تأكد من أن الروبوت ينقل 55 ميكرولتر من العينات المهضومة إلى الآبار في ألواح الآبار العميقة على الوحدة المغناطيسية. تحقق من إيقاف بروتوكول الروبوت مؤقتا وعرض الرسالة، تأكد من تحميل الخرز الجاهز في A6 من حامل الأنبوب ثنائي الملليلتر الموجود في الفتحة الرابعة قبل استئناف البروتوكول. ثم ، قم بتدوير دوامة حبات SP3 لفترة وجيزة في جهاز طرد مركزي صغير على الطاولة ووضعها في بئر A6 من رف الأنبوب ثنائي الملليلتر مع فتح الغطاء.
تحقق من إيقاف برنامج الروبوتات مؤقتا وعرض الرسالة ، تأكد من تحميل 80٪ من الإيثانول في A4 من رف الأنبوب 15 ملليلتر بالإضافة إلى 50 ملليلتر الموجود في الفتحة الخامسة قبل استئناف البروتوكول. ثم ، ضع محلول إيثانول 80٪ في بئر A4 في رف الأنبوب وانقر فوق استئناف للمتابعة. لاحظ بينما يغير الروبوت سرعة السحب لإبطاء ، ويشفط المادة الفائقة من كل بئر ، ويوزعها في أنبوب النفايات.
انتظر حتى يغير الروبوت سرعة السحب مرة أخرى إلى الوضع الافتراضي ويفصل الوحدة المغناطيسية. عندما يتم إيقاف برنامج الروبوتات مؤقتا ويعرض الرسالة ، افتح الغطاء على أنبوب بيكربونات الأمونيوم ، وافتح غطاء محلول بيكربونات الأمونيوم ، ثم انقر فوق استئناف للمتابعة. في وضع الاستعداد بينما يقوم الروبوت بفصل الوحدة المغناطيسية ، ينقل 250 ميكرولتر من المخزن المؤقت لبيكربونات الأمونيوم إلى كل بئر ، ويخلط على الفور لمدة 10 مرات.
بعد ذلك ، لاحظ بينما يغير الروبوت سرعة السحب إلى إبطاء ، وينقل supernatant من كل بئر إلى أنبوب النفايات. انتظر حتى ينقل الروبوت 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت لبيكربونات الأمونيوم إلى كل بئر ويخلط على الفور لمدة 10 مرات. تحقق من إيقاف برنامج الروبوتات مؤقتا وعرض الرسالة ، تأكد من وضع أنابيب تجميع جديدة في كتلة الألومنيوم ذات الملليلتر قبل استئناف البروتوكول.
بعد ذلك ، ضع مجموعة جديدة من أنابيب الطرد المركزي الدقيق منخفضة الاحتفاظ بالبروتين في كتلة الألومنيوم مباشرة بعد أنبوب العينة الأخير في البداية في الكتلة ، وانقر فوق استئناف للمتابعة. في وضع الاستعداد بينما ينقل الروبوت كل عينة في المخزن المؤقت لبيكربونات الأمونيوم إلى الأنابيب الجديدة التي يبلغ طولها مليلترين. عندما يتم إيقاف برنامج الروبوت مؤقتا ويعرض الرسالة، تأكد من تحميل التربسين في C6 من رف الأنبوب ثنائي الملليلتر الموجود في الفتحة الرابعة قبل استئناف البروتوكول، وضع محلول التربسين في بئر C6 من رف الأنبوب ثنائي الملليلتر مع فتح غطاء الأنبوب، وانقر على استئناف للمتابعة.
بمجرد الانتهاء من تشغيل البرنامج ، قم بلف أغطية أنبوب العينة بفيلم البارافين ، ونقل جميع العينات إلى خلاط يتم التحكم في درجة حرارته ، واحتضانه عند 37 درجة مئوية لمدة 16 إلى 20 ساعة مع اهتزاز 1000 دورة في الدقيقة. مع عينة BSA ، تم تحديد وسط من 728 تطابق طيف الببتيد و 65 الببتيد ، مع معاملات تباين 5.2٪ و 3.2٪ ، على التوالي. مع عينة قلب معقدة ، تم تحديد وسط من 9،526 تطابق طيف الببتيد ، و 7،558 الببتيد ، و 1،336 بروتين في 10 أشواط مع 7.6 ٪ 5.9 ٪ و 3.6 ٪ من معاملات التباين ، على التوالي.
لتحديد التباين في قياس كمية الببتيد ، تم حساب معاملات التباين في كثافة كروماتوجرام الأيونات المستخرجة ل 10 ببتيدات ترتبط ببروتين فريد. عندما تمت مقارنة تباين النتائج التجريبية للإنسان مقابل الروبوت في قياس تركيز البروتين مع فحص BCA ، كان متوسط معامل التباين في فحص BCA للروبوت أقل من فحص BCA اليدوي البشري. يقلل هذا البروتوكول من وقت الجلوس لمعالجة كل عينة.
إنه يمهد الطريق لنا لاستكشاف الاختلافات في البروتينات في لوحة من خطوط الخلايا بين العلاجات الدوائية المتعددة.
