Bu protokol, kütle spektrometrisi deneylerinden önce protein biyokimyası preparatlarını gerçekleştirmek için otomasyon kullanır ve proteomik çalışmalar için daha yüksek verim ve daha düşük değişkenlik sağlar. Bu protokol, daha fazla laboratuvar için uygun fiyatlı düşük maliyetli, programlanabilir bir sıvı taşıma sistemi kullanır. Daha fazla geliştirme için değiştirilebilen açık kaynaklı Python komut dosyaları sunuyoruz.
Prosedürü gösteren milton Amaya, laboratuvarımızda yüksek lisans öğrencisi. Başlamak için noSP3_Digestion açın. py komut dosyasını metin düzenleyicisinde bulabilirsiniz ve yalnızca BURADA ÖZELLeştİr bölümünde denemeye özgü değişkenleri gerektiği gibi belirtin.
Ardından, Opentrons uygulamasını açın ve komut dosyasını Opentrons uygulamasındaki Protokol sekmesine yükleyin. Ardından, gerekli labware ve pipetleri Python komut dosyasında belirtilen OT2 destesinde ilgili konuma yerleştirin. Ardından, amonyum bikarbonat çözeltisini 15 mililitre artı 50 mililitre tüp tutucu üst ile dört arada tüp rafının A1 kuyusuna yerleştirin ve protein örneğini iki mililitrelik tüp tutucu üstlü dört arada tüp rafının A1 kuyusuna yerleştirin.
A1'den başlayıp dikey olarak aşağı doğru hareket ederek sıcaklık modülünün üzerine yerleştirilen alüminyum bloğun kuyularına iki mililitre proteinli düşük bağlayıcı boruları manuel olarak yerleştirin. Ardından, DTT çözeltisini iki mililitrelik bir tüp tutucu üst kısmına sahip dört'ü bir arada tüp rafının A6 kuyusuna yerleştirin. Robot, alüminyum bloktaki numune tüplerine uygun miktarda amonyum bikarbonat tamponu aktarırken gözlemleyin.
Ardından, robot programının duraklatıldığını manuel olarak doğrulayın ve mesajı görüntüler, DTT'nin protokole devam etmeden önce yuva dört'te bulunan iki mililitrelik tüp rafının A6'sına yüklendiğinden emin olun. DTT tüpünün konumunu onayladıktan ve tüp kapağını açtıktan sonra, devam etmek için Opentrons uygulamasındaki Özgeçmiş düğmesine tıklayın. Robotun her numuneye 10 mikrolitre DTT çözeltisi aktardığından ve ardından beş karıştırma mermisi aktardığından emin olun.
Ardından, robot programının duraklatıldığından emin olun ve mesajı görüntüler, Örnek tüplerdeki kapakları kapattığından emin olun. Ardından, tüplerin kapaklarını manuel olarak kapatın ve devam etmek için Devam Et'e tıklayın. Robotun sıcaklık modülü alüminyum bloğu ısıtmaya başlayana ve sıcaklık 55 santigrat dereceye ulaşana kadar bekleyin, ardından numunelerin 55 santigrat dereceye ulaşmasını sağlamak için beş dakikalık bir kuluçka.
Robot daha sonra DTT tarafından protein azaltımını sağlamak için bu sıcaklığı 30 dakika tutacaktır. Kuluçka sırasında, ışığa maruz kalmamak için iodoasetamid çözeltisi hazırlayın ve alüminyum folyo ile manuel olarak sarın. Kuluçkadan sonra, robotun programı duraklatıldığında ve uyarı mesajını görüntülediğinde, örnek tüplerde kapakları açtığından emin olun, örnek tüplerin kapağını açın ve devam etmek için Devam Et'e tıklayın.
Daha sonra, robotun programının uyarı mesajıyla duraklatıldığını manuel olarak doğrulayın, protokolü sürdürmeden önce iodoasetamid'in yuva dörtte bulunan iki mililitrelik tüp rafının B6'sına yüklendiğinden emin olun. İodoasetamid tüpünün raf konumunu onayladıktan ve tüp kapağını açtıktan sonra, Özgeçmiş'e tıklayın ve robotun her örnek tüpe 10 mikrolitre iodoasetamid çözeltisi aktardığından ve ardından beş karıştırma mermisi aktardığından emin olun. Robotun programı duraklatıldığında ve mesajı görüntülediğinde, Örnek tüplere kapakları kapatın, numune tüplerini kaplayın ve folyo ile örtün, ardından tüm alüminyum bloğu temiz bir folyo parçasıyla örtün ve devam etmek için Devam Et'e tıklayın.
Numuneler 30 dakika boyunca 22 santigrat derecede inkübe edilene kadar bekleyin ve iodoasetamid inkübasyonunun tamamlanmasıyla robotun sıcaklık modülünün devre dışı kalmasını sağlayın. Robotun programı duraklatıldığında ve uyarı mesajını görüntülediğinde, trypsin'in devam protokolünden önce dördüncü yuvada bulunan iki mililitrelik tüp rafının C6'sına yüklendiğinden emin olun, tripin çözeltisini tüp kapağı açık olan iki mililitrelik tüp rafının C6 kuyusuna yerleştirin ve devam etmek için Devam Et'e tıklayın. Ardından, robotun programı duraklatıldığında ve uyarı mesajını görüntülediğinde, sıcaklık modülündeki örnek tüplerde kapakları açın, örnek tüplerin kapağını açın ve devam etmek için Devam Et'e tıklayın.
Robot her numune tüpüne 10 mikrolitre tripsin aktarırken beklemede kalın, ardından beş karıştırma mermisi. Bir gecede tripsin sindirimden sonra, numuneleri bir tezgah üstü mikrosantrifüj kullanarak kısa bir süre döndürün ve numuneleri manyetik bir tüp rafı üzerine yerleştirin. İki dakika sonra, süpernatantı bir pipetle dikkatlice yeni bir protein düşük bağlı mikrosantrifüj tüpleri kümesine aktarın ve numuneleri bir buzdolabında saklayın.
Ardından, SP3_peptide_cleanup açın. py Python komut dosyasını bir metin düzenleyicisinde tıklatın ve deneme değişkenlerini yalnızca BURADA ÖZELLeştİr bölümünde gerektiği gibi belirtin. Ardından, komut dosyasını Opentrons uygulamasındaki Protokol sekmesine yükleyin.
Gerekli labware ve pipetleri Python komut dosyasında belirtilen OT2 destesinde ilgili konuma yerleştirin ve manyetik modülün açık ve robota bağlı olduğundan emin olun. Manyetik modülün üstüne yeni, iki mililitrelik, 96 kuyu derinliğinde bir kuyu plakası yerleştirin. Ardından, sindirilen numuneleri A1'den başlayıp dikey olarak aşağı hareket eden iki mililitrelik tüp rafa yerleştirin.
Daha sonra, robotun sindirilen numunelerin 55 mikrolitresini manyetik modüldeki derin kuyu plakalarındaki kuyulara aktardığından emin olun. Robot protokolünün duraklatıldığını doğrulayın ve mesajı görüntüler, Protokole devam etmeden önce hazırlanan boncukların yuva dörtte bulunan iki mililitrelik tüp rafının A6'sına yüklendiğinden emin olun. Daha sonra, vorteks ve kısa bir süre SP3 boncuklarını mini tezgah üstü santrifüjde döndürün ve kapağı açık olan iki mililitrelik tüp rafının A6 kuyusuna yerleştirin.
Robot programının duraklatıldığını doğrulayın ve mesajı görüntüler, devam protokolünden önce yuva beşte bulunan 15 mililitre artı 50 mililitrelik tüp rafının A4'üne %80 etanol yüklendiğinden emin olun. Ardından, tüp rafındaki A4 kuyusuna% 80 etanol çözeltisi yerleştirin ve devam etmek için Devam Et'e tıklayın. Robot pipet hızını yavaşlamak için değiştirirken gözlemleyin, her kuyudan süpernatantı aspire eder ve atık tüpüne dağıtır.
Robot pipetleme hızını varsayılana döndürüp manyetik modülü devre dışı bırakana kadar bekleyin. Robotlar programı duraklatıldığında ve mesajı görüntülediğinde, amonyum bikarbonat tüpünde kapağı açın, amonyum bikarbonat çözeltisinin kapağını açın, ardından devam etmek için Devam Et'e tıklayın. Robot manyetik modülü devre dışı bırakarak, amonyum bikarbonat tamponunun 250 mikrolitresini her kuyuya aktarır ve hemen 10 kez karıştırır.
Ardından, robot pipetleme hızını yavaşlamak için değiştirirken gözlemleyin ve süpernatantı her kuyudan atık tüpüne aktarın. Robot, amonyum bikarbonat tamponunun 100 mikrolitresini her kuyuya aktarana ve hemen 10 kez karışana kadar bekleyin. Robotlar programının duraklatıldığını doğrulayın ve mesajı görüntüler, Protokol devam etmeden önce iki mililitrelik alüminyum bloğa yeni toplama tüplerinin yerleştirildiklerinden emin olun.
Ardından, başlangıçta bloktaki son numune tüpünden hemen sonra alüminyum bloğa yeni bir düşük protein tutma mikrosantrifüj tüpü seti yerleştirin ve devam etmek için Devam Et'e tıklayın. Robot amonyum bikarbonat tamponundaki her numuneyi yeni iki mililitreli tüplere aktarırken beklemeyin. Robotun programı duraklatıldığında ve mesajı görüntülediğinde, trypsin'in devam protokolünden önce dördüncü yuvada bulunan iki mililitrelik tüp rafının C6'sına yüklendiğinden emin olun, tripin çözeltisini tüp kapağı açık olan iki mililitrelik tüp rafının C6 kuyusuna yerleştirin ve devam etmek için Devam Et'e tıklayın.
Program tamamlandıktan sonra, numune tüp kapaklarını parafin filmi ile sarın, tüm örnekleri sıcaklık kontrollü bir karıştırıcıya aktarın ve 1.000 RPM sallanarak 16 ila 20 saat boyunca 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. BSA örneği ile sırasıyla %5,2 ve %3,2 değişim katsayısı ile 728 peptit spektrum eşleşmesi ve 65 peptit ortamı tanımlanmıştır. Karmaşık bir kalp örneği ile 9.526 peptit spektrumu eşleşmesi, 7.558 peptit ve 1.336 proteinin bulunduğu 10 koşuda sırasıyla %7.6%5.9 ve %3.6 değişim katsayıları tespit edildi.
Peptit niceliğindeki değişkenliği belirlemek için, çıkarılan iyon kromatogram yoğunluklarının varyasyon katsayıları, benzersiz bir proteinle eşlenen 10 peptit için hesaplandı. Protein konsantrasyonunun ölçülmesinde insan ve robot deneysel sonuçlarının değişkenlikleri BCA testine kıyasla daha fazla olduğunda, robot BCA testinin ortalama değişim katsayısı insan el kitabı BCA testinden daha düşüktü. Bu protokol, her örneği işlemek için tezgah süresini azaltır.
Birden fazla ilaç tedavisi arasındaki hücre hatları panelinde proteomik farklılıkları keşfetmemizin yolunu açıyor.
