Este protocolo utiliza a automação para realizar preparações de bioquímica proteica antes de experimentos de espectrometria de massa, permitindo maior rendimento e menor variabilidade para estudos proteômicos. Este protocolo usa um sistema de manuseio líquido programável de baixo custo que é acessível a mais laboratórios. Fornecemos scripts Python de código aberto que podem ser modificados para desenvolvimento posterior.
Demonstrando o procedimento estará Milton Amaya, um estudante de mestrado em nosso laboratório. Para começar, abra o noSP3_Digestion. py script no editor de texto e especifique as variáveis específicas do experimento conforme necessário na seção PERSONALIZAR AQUI SOMENTE.
Em seguida, abra o aplicativo Opentrons e carregue o script para a guia Protocolo no aplicativo Opentrons. Em seguida, coloque os labware e pipetas necessários no local correspondente no deck OT2 especificado no script Python. Em seguida, coloque a solução de bicarbonato de amônio no poço A1 do rack de tubo quatro em um com o suporte de tubo de 15 mililitros mais 50 mililitros e coloque a amostra de proteína no poço A1 do rack de tubo quatro em um com um topo superior de porta-tubos de dois mililitros.
Coloque manualmente tubos de baixa ligação de proteína de dois mililitros nos poços do bloco de alumínio colocados em cima do módulo de temperatura, começando a partir de A1 e movendo-se verticalmente para baixo. Em seguida, coloque a solução DTT no poço A6 do rack de tubo quatro em um com um topo de tubo de dois mililitros. Observe enquanto o robô transfere um volume apropriado do tampão de bicarbonato de amônio para os tubos de amostra no bloco de alumínio.
Em seguida, verifique manualmente se o programa do robô está pausado e exibe a mensagem, certifique-se de que o DTT tenha sido carregado em A6 do rack de tubo de dois mililitros localizado no slot quatro antes de retomar o protocolo. Depois de confirmar a localização do tubo DTT e abrir a tampa do tubo, clique no botão Retomar no aplicativo Opentrons para continuar. Certifique-se de que o robô transfira 10 microliters da solução DTT para cada amostra bem, seguido por cinco rodadas de mistura.
Em seguida, verifique se o programa robô está pausado e exibe a mensagem, Certifique-se de fechar tampas em tubos de amostra. Em seguida, feche manualmente as tampas dos tubos e clique em Retomar para continuar. Espere até que o módulo de temperatura do robô comece a aquecer o bloco de alumínio e a temperatura atinja 55 graus Celsius, seguido de uma incubação de cinco minutos para permitir que as amostras cheguem a 55 graus Celsius.
O robô então manterá esta temperatura por 30 minutos para permitir a redução de proteínas por DTT. Durante a incubação, prepare a solução de iodoacetamida e enrole-a manualmente com papel alumínio para evitar exposição à luz. Após a incubação, quando o programa do robô é pausado e exibe a mensagem de aviso, Certifique-se de abrir tampas em tubos de amostra, deslecotar os tubos de amostra e clicar em Retomar para continuar.
Em seguida, verifique manualmente se o programa do robô está pausado com a mensagem de aviso, Certifique-se de que a iodoacetamida tenha sido carregada em B6 do rack de tubo de dois mililitros localizado no slot quatro antes de retomar o protocolo. Depois de confirmar a localização do rack do tubo de iodoacetamida e abrir a tampa do tubo, clique em Retomar e certifique-se de que o robô transfira 10 microliters da solução de iodoacetamida para cada tubo de amostra, seguido por cinco rodadas de mistura. Quando o programa do robô é pausado e exibe a mensagem, feche as tampas nos tubos de amostra, cubra os tubos de amostra e cubra-os com papel alumínio, em seguida, cubra todo o bloco de alumínio com um pedaço limpo de papel alumínio e clique em Retomar para continuar.
Aguarde até que as amostras sejam incubadas a 22 graus Celsius por 30 minutos e certifique-se de que o módulo de temperatura do robô desativa após a conclusão da incubação da iodoacetamida. Quando o programa do robô é pausado e exibe a mensagem de aviso, certifique-se de que a trippsina tenha sido carregada em C6 do rack de tubo de dois mililitros localizado na ranhura quatro antes de retomar o protocolo, coloque a solução de trippsina no poço C6 do rack de tubo de dois mililitros com a tampa do tubo aberta e clique em Retomar para continuar. Em seguida, quando o programa do robô é pausado e exibe a mensagem de aviso, abra as tampas nos tubos de amostra no módulo de temperatura, desleule os tubos de amostra e clique em Retomar para continuar.
Espera enquanto o robô transfere 10 microliters de trippsina para cada tubo de amostra, seguido por cinco rodadas de mistura. Após a digestão da trippsina durante a noite, gire brevemente as amostras usando um microcentrifuuge benchtop e coloque as amostras em um rack de tubo magnético. Após dois minutos, transfira o supernatante cuidadosamente com uma pipeta para um novo conjunto de tubos de microcentrifuge de baixa ligação proteica, e mantenha as amostras em uma geladeira.
Em seguida, abra o SP3_peptide_cleanup. py Python script em um editor de texto e especifique as variáveis de experimento conforme necessário na seção PERSONALIZAR AQUI SOMENTE. Em seguida, carregue o script na guia Protocolo no aplicativo Opentrons.
Coloque os labware e pipetas necessários no local correspondente no deck OT2 especificado no script Python e certifique-se de que o módulo magnético esteja ligado e conectado ao robô. Coloque uma nova placa de dois mililitros, 96 bem fundo no topo do módulo magnético. Em seguida, coloque as amostras digeridas no rack de tubo de dois mililitros a partir de A1 e movendo-se verticalmente para baixo.
Em seguida, certifique-se de que o robô transfira 55 microliters das amostras digeridas para os poços nas placas profundas do poço no módulo magnético. Verifique se o protocolo do robô está pausado e exibe a mensagem, certifique-se de que as contas preparadas tenham sido carregadas em A6 do rack de tubo de dois mililitros localizado na ranhura quatro antes de retomar o protocolo. Em seguida, o vórtice e gire brevemente as contas SP3 em uma centrífuga mini-bancada e coloque-as no poço A6 do rack de tubo de dois mililitros com a tampa aberta.
Verifique se o programa de robôs é pausado e exibe a mensagem, certifique-se de que 80% de etanol tenha sido carregado em A4 do rack de tubo de 15 mililitros mais 50 mililitros localizado no slot cinco antes de retomar o protocolo. Em seguida, coloque uma solução de 80% de etanol no poço A4 no rack do tubo e clique em Retomar para continuar. Observe enquanto o robô muda a velocidade de pipetação para diminuir, aspira o supernatante de cada poço e o distribui para o tubo de resíduo.
Aguarde até que o robô mude a velocidade de pipetação de volta ao padrão e desengaja o módulo magnético. Quando o programa de robôs é pausado e exibe a mensagem, abra a tampa no tubo de bicarbonato de amônio, abra a tampa da solução de bicarbonato de amônio e clique em Retomar para continuar. Em espera enquanto o robô desengata o módulo magnético, transfere 250 microliters do tampão de bicarbonato de amônio para cada poço, e imediatamente se mistura por 10 vezes.
Em seguida, observe enquanto o robô muda a velocidade de pipetação para diminuir, e transfere o supernatante de cada poço para o tubo de resíduo. Espere até que o robô transfira 100 microliters do tampão de bicarbonato de amônio para cada poço e se misture imediatamente por 10 vezes. Verifique se o programa de robôs está pausado e exibe a mensagem, certifique-se de que novos tubos de coleta tenham sido colocados no bloco de alumínio de dois mililitros antes de retomar o protocolo.
Em seguida, coloque um novo conjunto de tubos de microcentrifusagem de baixa retenção de proteínas no bloco de alumínio imediatamente após o último tubo de amostra inicialmente no bloco, e clique em Retomar para continuar. Espera enquanto o robô transfere cada amostra no tampão de bicarbonato de amônio para os novos tubos de dois mililitros. Quando o programa do robô é pausado e exibe a mensagem, certifique-se de que a trippsina tenha sido carregada em C6 do rack de tubo de dois mililitros localizado na ranhura quatro antes de retomar o protocolo, coloque a solução de trippsina no poço C6 do rack de tubo de dois mililitros com a tampa do tubo aberta e clique em Retomar para continuar.
Uma vez que o programa termine de funcionar, enrole as tampas do tubo de amostra com filme de parafina, transfira todas as amostras para uma batedeira controlada pela temperatura e incubar a 37 graus Celsius por 16 a 20 horas com 1.000 RPM tremendo. Com a amostra BSA, foram identificados 728 fósforos de espectro de peptídeos e 65 peptídeos, com coeficientes de variação de 5,2% e 3,2%, respectivamente. Com amostra cardíaca complexa, médio de 9.526 fósforos de espectro de peptídeos, 7.558 peptídeos e 1, 336 proteínas foram identificadas em 10 corridas com 7,6%5,9% e 3,6% de variação, respectivamente.
Para determinar a variabilidade na quantificação do peptídeo, os coeficientes de variação das intensidades de cromatograma de íon extraído foram calculados para 10 peptídeos que mapeiam para uma proteína única. Quando as variabilidades dos resultados experimentais humanos versus robôs na medição da concentração proteica foram ainda mais comparadas com o ensaio do BCA, o coeficiente médio de variação do ensaio BCA robô foi menor do que o ensaio bca manual humano. Este protocolo reduz o tempo de banco para o processamento de cada amostra.
Abre o caminho para explorarmos diferenças proteômicas em um painel de linhas celulares entre múltiplos tratamentos medicamentosos.
