このプロトコルは、質量分析の実験の前にタンパク質の生化学の準備を実行するために自動化を使用し、より高いスループットとプロテオミクス研究のためのより低い変動性を可能にします。このプロトコルは、より多くの実験室に手頃な価格である低コスト、プログラム可能な液体処理システムを使用しています。私たちは、さらなる開発のために変更することができるオープンソースのPythonスクリプトを提供します。
この手順のデモンストレーションは、当研究室の修士課程の学生であるミルトン・アマヤです。開始するには、noSP3_Digestionを開きます。py スクリプトをテキストエディタで実行し、必要に応じて「ここでのみカスタマイズ」セクションで実験固有の変数を指定します。
次に、Opentrons アプリを開き、Opentrons アプリの [プロトコル] タブにスクリプトをアップロードします。次に、Python スクリプトで指定された OT2 デッキの対応する場所に、必要なラボウェアとピペットを配置します。次に、15ミリリットルプラス50ミリリットルチューブホルダートップを備えた4インワンチューブラックのA1ウェルに炭酸水素アンモニウム溶液を置き、2ミリリットルチューブホルダートップを備えた4インワンチューブラックのA1ウェルにタンパク質サンプルを配置します。
温度モジュールの上に置かれたアルミニウムブロックの井戸に2ミリリットルのタンパク質低結合チューブを手動で配置し、A1から垂直に下に移動します。次に、DTT溶液を2ミリリットルチューブホルダートップを備えた4インワンチューブラックのA6ウェルに入れます。ロボットがアルミニウムブロック内のサンプルチューブに適量の重炭酸アンモネートバッファーを転送している間に観察します。
次に、手動でロボットプログラムが一時停止していることを確認し、プロトコルを再開する前にスロット4にある2ミリリットルチューブラックのA6にDTTがロードされていることを確認するメッセージを表示します。DTTチューブの位置を確認し、チューブキャップを開けた後、Opentronsアプリの再開ボタンをクリックして続行します。ロボットがDTT溶液の10マイクロリットルを各サンプルにうまく転送し、その後に5回の混合ラウンドを行うことを確認します。
次に、ロボットプログラムが一時停止していることを確認し、「サンプルチューブのキャップを閉じるようにする」というメッセージが表示されます。次に、チューブのキャップを手動で閉じ、[再開]をクリックして続行します。ロボットの温度モジュールがアルミニウムブロックを加熱し始め、温度が摂氏55度に達するまで待ち、その後5分間のインキュベーションを行い、サンプルを摂氏55度にします。
ロボットはこの温度を30分間保持し、DTTによるタンパク質還元を可能にします。インキュベーション中に、ヨドアセトアミド溶液を調製し、手動でアルミニウム箔で包み、光への暴露を避けます。インキュベーションの後、ロボットのプログラムが一時停止し、警告メッセージが表示されたら、サンプルチューブのキャップを開き、サンプルチューブのキャップを解除し、再開をクリックして続行します。
次に、手動でロボットのプログラムが警告メッセージで一時停止されていることを確認し、プロトコルを再開する前に、スロット4にある2ミリリットルチューブラックのB6にIodoacetamideがロードされていることを確認します。ヨウアセトアセトアミドチューブのラック位置を確認し、チューブキャップを開けた後、Resumeをクリックして、ロボットが各サンプルチューブに10マイクロリットルのヨードアセトアセトアミド溶液を転送し、その後5回の混合ラウンドを確実に行います。ロボットのプログラムが一時停止し、メッセージを表示すると、サンプルチューブのキャップを閉じて、サンプルチューブをキャップし、ホイルでそれらをカバーし、きれいな箔でアルミニウムブロック全体をカバーし、続行するために再開をクリックします。
サンプルが摂氏22度で30分間インキュベートされるまで待ち、ヨウドアセトアミドインキュベートが完了するとロボットの温度モジュールが非活性化することを確認します。ロボットのプログラムが一時停止し、警告メッセージが表示されたら、プロトコルを再開する前にスロット4に配置された2ミリリットルチューブラックのC6にトリプシンがロードされていることを確認し、チューブキャップを開いた状態で2ミリリットルチューブラックのC6ウェルにトリプシン溶液を配置し、再開をクリックして続行します。次に、ロボットのプログラムが一時停止し、警告メッセージが表示されたら、温度モジュールのサンプルチューブのキャップを開き、サンプルチューブのキャップを解除し、再開をクリックして続行します。
スタンバイしながら、ロボットは各サンプルチューブにトリプシンの10マイクロリットルを転送し、その後5つの混合ラウンドが続きます。一晩トリプシン消化した後、ベンチトップマイクロ遠心分離機を使用してサンプルを簡単に回転させ、サンプルを磁気チューブラックに置きます。2分後、上清をピペットで慎重に低結合マイクロ遠心チューブの新しいセットに移し、サンプルを冷蔵庫に保管します。
次に、SP3_peptide_cleanupを開きます。py Python スクリプトをテキスト エディタで実行し、必要に応じて「ここでのみカスタマイズ」セクションで実験変数を指定します。次に、Opentrons アプリの [プロトコル] タブにスクリプトをアップロードします。
必要なラボウェアとピペットを、Python スクリプトで指定された OT2 デッキの対応する場所に配置し、磁気モジュールの電源がオンになって、ロボットに接続されていることを確認します。磁気モジュールの上部に、新しい2ミリリットル、96ウェルの深いウェルプレートを置きます。次に、消化したサンプルをA1から始めて垂直に下に移動する2ミリリットルのチューブラックに入れます。
次に、ロボットが磁性モジュールの深い井戸プレートのウェルに消化されたサンプルの55マイクロリットルを転送することを確認します。ロボットプロトコルが一時停止され、メッセージが表示されていることを確認し、プロトコルを再開する前にスロット4にある2ミリリットルチューブラックのA6に準備されたビーズがロードされていることを確認します。その後、渦を巻き、SP3ビーズをミニベンチトップ遠心分離機で短時間回転させ、キャップを開けた2ミリリットルチューブラックのA6ウェルに置きます。
ロボットプログラムが一時停止され、メッセージが表示されていることを確認し、80%エタノールがプロトコルを再開する前にスロット5にある15ミリリットルプラス50ミリリットルのチューブラックのA4にロードされていることを確認します。その後、80%エタノール溶液をチューブラックのA4ウェルに入れ、再開ボタンをクリックして続行します。ロボットがピペット速度を遅くしながら観察し、各井戸から上澄み物を吸引し、それを廃管に分配します。
ロボットがピペットの速度をデフォルトに戻し、磁気モジュールを外すまで待ちます。ロボットプログラムが一時停止し、メッセージを表示すると、メッセージ、重炭酸アンモニウムチューブのオープンキャップ、重炭酸アンモニウム溶液のキャップを開き、続行するために再開をクリックします。ロボットが磁気モジュールを外している間にスタンバイ、各ウェルに炭酸アンモニウムバッファーの250マイクロリットルを転送し、すぐに10回混合します。
次に、ロボットがピペット速度を遅くしながら観察し、各ウェルから上澄み液を廃棄物管に移します。ロボットが各井戸に炭酸アンモニウムバッファーの 100 マイクロリットルを転送し、すぐに 10 回混合するまで待ちます。ロボットプログラムが一時停止され、メッセージが表示されていることを確認します, 新しいコレクションチューブがプロトコルを再開する前に2ミリリットルアルミニウムブロックに配置されていることを確認します.
次に、最後のサンプルチューブの直後にアルミニウムブロックに低タンパク質保持マイクロ遠心チューブの新しいセットを配置し、再開をクリックして続行します。ロボットが重炭酸アンモニウムバッファー内の各サンプルを新しい 2 ミリリットルチューブに移す間スタンバイ。ロボットのプログラムが一時停止し、メッセージを表示すると、プロトコルを再開する前にスロット4に配置された2ミリリットルチューブラックのC6にトリプシンがロードされていることを確認し、チューブキャップを開いた2ミリリットルチューブラックのC6ウェルにトリプシン溶液を配置し、再開をクリックして続行します。
プログラムの実行が完了したら、サンプルチューブキャップをパラフィンフィルムで包み、すべてのサンプルを温度制御ミキサーに移し、1,000 RPMの揺れで摂氏37度で16〜20時間インキュベートします。BSAサンプルでは、それぞれ5.2%と3.2%の変動係数を持つ728ペプチドスペクトルマッチと65ペプチドの培地が同定されました。複合心臓サンプルでは、9、526個のペプチドスペクトルが一致する培地、7、558ペプチド、1、336個のタンパク質がそれぞれ7.6%5.9%と3.6%の変動係数で10回で同定されました。
ペプチド定量のばらつきを決定するために、抽出されたイオンクロマトグラム強度の変動係数を、ユニークなタンパク質にマッピングする10個のペプチドについて計算した。ヒト対ロボット実験結果の変動性がBCAアッセイと比較してさらに比較された場合、ロボットBCAアッセイの変動係数の平均は、ヒトマニュアルBCAアッセイよりも低かった。このプロトコルは、各サンプルを処理するためのベンチ時間を短縮します。
これは、複数の薬物治療の間の細胞株のパネルにおけるプロテオミクスの違いを探求する道を開きます。
