العلاج القائم على الخلايا لديه إمكانات هائلة لتجديد الدماغ. البروتوكول الذي نوضحه هنا ذو قيمة ، لأنه يسمح بالتصوير الطولي في الجسم الحي للخلايا المزروعة في دماغ الفأر. هذا البروتوكول مفيد بشكل خاص لاكتساب رؤى حول هجرة وبقاء الكسب غير المشروع في نفس الحيوان على مدى فترة من الزمن.
يمكن تطبيق هذا الإجراء على أي خط خلوي يعبر عن لوسيفيراز مزروع في دماغ الفأر. ومع ذلك ، قد تختلف قوة الإشارة اعتمادا على عمق عملية الزرع أو تعبير luciferase في خط الخلية المعني. ستوضح ريبيكا ويبر الإجراء ، وهي طالبة دكتوراه ممتازة في مختبرنا.
ابدأ بجمع قارورة من الخلايا من تخزين 150 درجة مئوية تحت الصفر ونقلها إلى المختبر. انقل القارورة بسرعة إلى حمام مائي خفف من درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق حتى تذوب بلورات الجليد. ثم ، انقل القارورة إلى خزانة السلامة الأحيائية وقم بماصة المحتوى بأكمله في أنبوب مخروطي معقم سعة 15 ملليلتر.
أضف تسعة ملليلترات من PBS المعقمة وأجهزة الطرد المركزي عند 300 جم لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. قم بإزالة السوبرناتانت عن طريق الشفط دون إزعاج الكريات وعد الخلايا قبل الدوران النهائي باستخدام عداد خلية آلي. نقل الحيوان من غرفة الحث إلى الإطار المجسم، والحفاظ على التخدير باستخدام قناع الوجه.
ضع مواد التشحيم العينية لمنع العينين من الجفاف. احلق فروة رأس الفأر باستخدام ماكينة حلاقة كهربائية وقم بتطهير الجلد بمحلول بيتادين بنسبة 5٪ باستخدام مسحات القطن. قم بتأمين رأس الماوس وأدخل قضبان الأذن في الصماخ الخارجي.
حفر حفرة بقطر 2 إلى ثلاثة ملليمترات من خلال الجمجمة باستخدام مثقاب أسنان جراحي. أعد تعليق الخلايا المحضرة في الأنبوب واسحب ميكرولترين من تعليق الخلايا في حقنة. ضع المحقنة فوق الموقع المستهدف وحرك الإبرة ببطء إلى سطح الجافية واحسب إحداثيات العمق.
انقر نقرا مزدوجا فوق رمز برنامج Living Image وحدد معرف مستخدم من القائمة المنسدلة. ثم انقر فوق تهيئة في لوحة التحكم التي تظهر. في برنامج Living Image، حدد المربعين Luminescent و Photo (صورة فوتوغرافية) في لوحة التحكم وحدد التعريض الضوئي التلقائي.
حدد مجال عرض. أدخل ارتفاع الهدف وحدد خيار استخدام التركيز البؤري لارتفاع الهدف. قم بتعيين معلمات التصفية يدويا بما في ذلك الربط الكبير و F/Stop ومرشح الإثارة المحظور ومرشح الانبعاثات المفتوح.
حقن لوسيفيرين داخل الصفاق ، وبعد خمس دقائق ، تخدير الحيوانات مع إمدادات مستمرة من الأيزوفلوران. حلق الحيوانات المخدرة على منطقة الرأس باستخدام ماكينة حلاقة الشعر التقليدية. ضع الحيوان في غرفة التصوير وابدأ التصوير بعد 15 دقيقة من حقن لوسيفيرين بالنقر فوق اكتساب في لوحة التحكم.
قبل زرع الخلايا السلفية العصبية في دماغ الفأر ، تم اختبار الخلايا للنقل الناجح عن طريق التعبير عن EGFP في المختبر. تم تأكيد عملية الزرع الناجحة من خلال وجود إشارة luciferase اليراع الحمراء. بعد زرع 6،000 إلى 180،000 خلية في القشرة الحركية الحسية اليمنى للفأر ، كانت إشارة التلألؤ الحيوي قابلة للكشف في جميع التركيزات.
نجت الخلايا لمدة خمسة أسابيع على الأقل بعد الزرع. تم اكتشاف الخلايا المزروعة بنجاح خارج الجسم الحي في تحليل نسيجي لاحق من خلال مراسل EGFP والتلطيخ المناعي بالنوى المضادة للإنسان. من المهم جدا حساب إحداثيات الحقن بعناية لتجنب فقدان الموقع المستهدف.
وأيضا ، اترك المحقنة في مكانها لمدة خمس دقائق على الأقل بعد الزرع لتجنب أي ارتجاع. بعد التصوير الحيوي في الجسم الحي ، يمكن إعداد أنسجة المخ إما للتحليل النسيجي ، أو يمكن عزل الخلايا المزروعة باستخدام FACS وتتميز بتقنيات مختلفة أو مختلطة. بشكل عام ، توفر هذه التقنية تتبعا كميا ومستمرا للخلايا المزروعة في الدماغ ، ويمكن تطبيقها على عدد كبير من الأمراض العصبية بما في ذلك السكتة الدماغية وإصابات الدماغ الرضحية.
