לטיפול מבוסס תאים יש פוטנציאל עצום להתחדשות המוח. הפרוטוקול שאנו מדגימים כאן הוא בעל ערך, שכן הוא מאפשר הדמיה אורכית in vivo של תאים מושתלים במוח העכבר. פרוטוקול זה שימושי במיוחד כדי לקבל תובנות על הנדידה וההישרדות של השתל באותה חיה לאורך תקופה.
הליך זה יכול להיות מיושם על כל קו תאים מבטא לוציפראז המושתל במוח העכבר. עם זאת, עוצמת האות עשויה להשתנות בהתאם לעומק ההשתלה או לביטוי הלוציפראז בקו התא המתאים. מי שתדגים את ההליך תהיה רבקה וובר, דוקטורנטית מצוינת במעבדה שלנו.
התחילו באיסוף בקבוקון של תאים מאחסון מינוס 150 מעלות צלזיוס והעבירו אותו למעבדה. מעבירים במהירות את הבקבוקון לאמבטיית מים ממוזגת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שתיים-שלוש דקות עד שגבישי הקרח מתמוססים. לאחר מכן, מעבירים את הבקבוקון לארון הבטיחות הביולוגית ומקטרים את כל התוכן לצינור חרוטי סטרילי של 15 מיליליטר.
הוסיפו תשעה מיליליטרים של PBS סטרילי וצנטריפוגה ב-300 גרם למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. הסר את הסופרנטנט על ידי שאיפה מבלי להפריע לכדור וספור את התאים לפני הספין הסופי באמצעות מונה תאים אוטומטי. להעביר את החיה מתא האינדוקציה למסגרת הסטריאוטקסית, תוך שמירה על הרדמה באמצעות מסכת פנים.
יש למרוח חומר סיכה אופתלמי כדי למנוע מהעיניים להתייבש. גילחו את קרקפת העכבר בעזרת סכין גילוח חשמלי וחטאו את העור בתמיסת בטאדין 5% באמצעות צמר גפן. אבטחו את ראש העכבר והכניסו את מוטות האוזן לתוך הבשר החיצוני.
לקדוח חור בקוטר של שניים עד שלושה מילימטרים דרך הגולגולת באמצעות מקדחה דנטלית כירורגית. בצעו החייאה של התאים המוכנים בצינור ומשכו שני מיקרוליטרים של תרחיף התא למזרק. מניחים את המזרק מעל אתר המטרה ומזיזים באיטיות את המחט אל פני השטח של הדורה ומחשבים את קואורדינטות העומק.
לחץ פעמיים על סמל התוכנה Living Image ובחר מזהה משתמש מהרשימה הנפתחת. לאחר מכן, לחץ על אתחל בלוח הבקרה שמופיע. בתוכנת Living Image, סמן את התיבות זוהר ותצלום בלוח הבקרה ובחר חשיפה אוטומטית.
בחר שדה ראייה. הזן את גובה הנושא ובחר באפשרות השתמש באפשרות מיקוד גובה נושא. הגדר באופן ידני את פרמטרי הסינון כולל Binning גדול, F/Stop, מסנן עירור חסום ומסנן פליטה פתוח.
להזריק את לוציפרין באופן תוך-צפקי, ולאחר חמש דקות, להרדים בעלי חיים עם אספקת איזופלורן רציפה. גילחו את החיות המסוממות באזור הראש באמצעות מכונת גילוח שיער קונבנציונלית. מקם את החיה בתא ההדמיה והתחל לדמיין 15 דקות לאחר הזרקת לוציפרין על ידי לחיצה על רכוש בלוח הבקרה.
לפני השתלת תאי אב עצביים במוח העכבר, התאים נבדקו להתמרה מוצלחת על ידי ביטוי של EGFP במבחנה. ההשתלה המוצלחת אושרה על ידי נוכחותו של אות לוציפראז פיירפליי אדום. לאחר השתלה של 6, 000 עד 180, 000 תאים בקליפת המוח המוטורית החושית הימנית של העכבר, אות bioluminescence היה ניתן לזיהוי בכל הריכוזים.
התאים שרדו לפחות חמישה שבועות לאחר ההשתלה. התאים המושתלים זוהו בהצלחה ex vivo בניתוח היסטולוגי מאוחר יותר באמצעות כתב EGFP וחיסון עם גרעינים אנטי-אנושיים. חשוב מאוד לחשב בקפידה את קואורדינטות ההזרקה כדי למנוע החמצת אתר המטרה.
וגם, להשאיר את המזרק במקום לפחות חמש דקות לאחר ההשתלה כדי למנוע כל ריפלוקס. לאחר הדמיה ביולומינסנטית in vivo, ניתן להכין את רקמת המוח לניתוח היסטולוגי, או לבודד את התאים המושתלים באמצעות FACS ולאפיין אותם בטכנולוגיות שונות או מעורבות. באופן כללי, טכניקה זו מספקת מעקב כמותי ומתמשך אחר תאים מושתלים במוח, וניתן ליישם אותה על מספר עצום של מחלות נוירולוגיות כולל שבץ ופגיעה מוחית טראומטית.
