A terapia baseada em células tem um enorme potencial para a regeneração cerebral. O protocolo que demonstramos aqui é valioso, pois permite imagens longitudinais in vivo de células transplantadas no cérebro do camundongo. Este protocolo é especialmente útil para obter insights sobre a migração e a sobrevivência do enxerto no mesmo animal durante um período de tempo.
Este procedimento pode ser aplicado a qualquer linha celular que expresse a luciferase transplantada no cérebro do camundongo. No entanto, a força do sinal pode variar dependendo da profundidade do transplante ou da expressão da luciferase na respectiva linha celular. Demonstrando o procedimento estará Rebecca Weber, uma excelente doutoranda em nosso laboratório.
Comece coletando um frasco de células a partir de menos 150 graus Celsius de armazenamento e transfira-o para o laboratório. Transfira rapidamente o frasco para um banho de água temperado a 37 graus Celsius por dois a três minutos até que os cristais de gelo se dissolvam. Em seguida, transfira o frasco para o armário de biossegurança e pipeta todo o conteúdo em um tubo cônico estéril de 15 mililitros.
Adicione nove mililitros de PBS estéreis e centrífuga a 300 G por cinco minutos à temperatura ambiente. Remova o supernatante por aspiração sem perturbar a pelota e conte as células antes do giro final usando um contador celular automatizado. Transporte o animal da câmara de indução para o quadro estereotaxic, mantendo anestesia usando uma máscara facial.
Aplique lubrificante oftálmico para evitar que os olhos sequem. Raspe o couro cabeludo do rato com uma navalha elétrica e desinfete a pele com solução de 5% betadina usando cotonetes de algodão. Fixar a cabeça do mouse e inserir as barras de ouvido no meatus externo.
Faça um buraco com um diâmetro de dois a três milímetros através do crânio com uma broca dentária cirúrgica. Resuspenque as células preparadas no tubo e desenhe dois microliters de suspensão celular em uma seringa. Coloque a seringa acima do local alvo e mova lentamente a agulha para a superfície da dura e calcule as coordenadas de profundidade.
Clique duas vezes no ícone do software Living Image e selecione um ID do usuário na lista suspensa. Em seguida, clique em Inicializar no Painel de Controle que aparece. No software Living Image, verifique as caixas Luminescent e Photograph no Painel de Controle e selecione exposição automática.
Selecione um campo de visão. Digite a altura do assunto e selecione a opção de foco de altura do assunto de uso. Defina manualmente os parâmetros de filtragem, incluindo binning grande, F/Stop, filtro de excitação bloqueado e filtro de emissão aberto.
Injete a luciferina intraperitonealmente, e após cinco minutos, anestesia os animais com um suprimento contínuo de isoflurane. Raspe os animais sedados na região da cabeça usando um barbeador convencional de cabelo. Coloque o animal na câmara de imagem e comece a fotografar 15 minutos após a injeção de luciferina clicando em Adquirir no Painel de Controle.
Antes de transplantar células progenitoras neurais no cérebro do camundongo, as células foram testadas para transdução bem sucedida por expressão de EGFP in vitro. O transplante bem sucedido foi confirmado pela presença do sinal de luciferase firefly vermelho. Após o transplante de 6.000 a 180.000 células no córtex motor sensorial certo do camundongo, o sinal de bioluminescência foi detectável em todas as concentrações.
As células sobreviveram por pelo menos cinco semanas após o transplante. As células transplantadas foram detectadas com sucesso ex vivo em uma análise histológica subsequente através do repórter EGFP e imunostaining com núcleos anti-humanos. É muito importante calcular cuidadosamente as coordenadas de injeção para evitar perder o local alvo.
E também, deixe a seringa no lugar por pelo menos cinco minutos após o transplante para evitar qualquer refluxo. Após a imagem bioluminescente in vivo, o tecido cerebral pode ser preparado para análise histológica, ou as células transplantadas podem ser isoladas usando FACS e caracterizadas com tecnologias diferentes ou mistas. No geral, essa técnica fornece um rastreamento quantitativo e contínuo de células transplantadas no cérebro, e pode ser aplicada a um grande número de doenças neurológicas, incluindo derrame e lesão cerebral traumática.
