세포 기반 치료는 뇌 재생에 대한 엄청난 잠재력을 가지고 있습니다. 우리가 여기서 시연하는 프로토콜은 마우스 뇌에 이식 된 세포의 종방향 생체 내 이미징을 허용하므로 가치가 있습니다. 이 프로토콜은 일정 기간 동안 동일한 동물에서 이식편의 이동 및 생존에 대한 통찰력을 얻는 데 특히 유용합니다.
이 절차는 마우스 뇌에 이식된 임의의 루시페라아제 발현 세포주에 적용될 수 있다. 그러나, 신호 강도는 각각의 세포주에서의 이식 또는 루시퍼라제 발현의 깊이에 따라 달라질 수 있다. 절차를 시연하는 것은 우리 실험실의 우수한 박사 과정 학생 인 Rebecca Weber가 될 것입니다.
영하 150도 보관에서 세포 바이알을 수집하여 실험실로 옮기십시오. 얼음 결정이 녹을 때까지 섭씨 37도에서 두 세 분 동안 부드럽게 만든 수조로 바이알을 빠르게 옮깁니다. 그런 다음 바이알을 생물 안전 캐비닛으로 옮기고 전체 내용물을 멸균 된 15 밀리리터 원뿔형 튜브로 피펫하십시오.
9 밀리리터의 멸균 PBS를 첨가하고 실온에서 5분 동안 300 G에서 원심분리한다. 펠릿을 방해하지 않고 흡인에 의해 상층액을 제거하고 자동화 된 세포 카운터를 사용하여 최종 스핀 전에 세포를 계수하십시오. 유도 챔버에서 입체 택시 프레임으로 동물을 수송하고, 안면 마스크를 사용하여 마취를 유지한다.
눈이 마르지 않도록 안과 윤활제를 바르십시오. 전기 면도기로 마우스 두피를 면도하고 면봉을 사용하여 5 % betadine 용액으로 피부를 소독하십시오. 마우스 머리를 고정하고 이어 바를 외부 고기에 삽입하십시오.
외과 치과 드릴로 두개골을 통해 직경 두세 밀리미터의 구멍을 뚫습니다. 준비된 세포를 튜브에 재현탁시키고 두 마이크로 리터의 세포 현탁액을 주사기에 그립니다. 주사기를 표적 부위 위에 놓고 바늘을 경막 표면으로 천천히 움직이고 깊이 좌표를 계산하십시오.
Living Image 소프트웨어 아이콘을 두 번 클릭하고 드롭다운 목록에서 사용자 ID를 선택합니다. 그런 다음 나타나는 제어판에서 초기화를 클릭하십시오. Living Image 소프트웨어에서 제어판의 발광 및 사진 상자를 선택하고 자동 노출을 선택합니다.
시야각을 선택합니다. 피사체 높이를 입력하고 피사체 높이 초점 사용 옵션을 선택합니다. 대형 비닝, F/스톱, 차단된 여기 필터 및 개방 방출 필터를 포함한 필터링 매개 변수를 수동으로 설정합니다.
루시페린을 복강내 주사하고, 다섯 분 후, 지속적인 이소플루란 공급으로 동물을 마취시킨다. 기존의 헤어 면도기를 사용하여 머리 부위에 진정 된 동물을 면도하십시오. 동물을 이미징 챔버에 넣고 루시페린 주사 후 15 분 후에 제어판에서 획득을 클릭하여 이미징을 시작하십시오.
마우스 뇌에 신경 전구 세포를 이식하기 전에, 세포를 시험관 내에서 EGFP의 발현에 의한 성공적인 형질도입에 대해 시험하였다. 성공적인 이식은 적색 반딧불이 루시퍼라제 신호의 존재에 의해 확인되었다. 마우스의 우측 감각 운동 피질에 6, 000 내지 180, 000 세포를 이식한 후, 모든 농도에서 생체발광 신호를 검출할 수 있었다.
세포는 이식 후 적어도 다섯 주 동안 생존했다. 이식된 세포는 EGFP 리포터 및 항인간 핵으로 면역염색을 통한 후속 조직학적 분석을 통해 생체외에서 성공적으로 검출되었다. 목표 부위가 누락되지 않도록 주입 좌표를 신중하게 계산하는 것이 매우 중요합니다.
또한 역류를 피하기 위해 이식 후 적어도 다섯 분 동안 주사기를 제자리에 두십시오. 생체 내 생체 발광 이미징 후, 뇌 조직은 조직학적 분석을 위해 준비되거나, 이식된 세포는 FACS를 사용하여 분리될 수 있고 상이한 또는 혼합된 기술로 특성화될 수 있다. 전반적으로,이 기술은 뇌에 이식 된 세포의 양적 및 지속적인 추적을 제공하며, 뇌졸중 및 외상성 뇌 손상을 포함한 수많은 신경 질환에 적용될 수 있습니다.
