La terapia basada en células tiene un enorme potencial para la regeneración cerebral. El protocolo que demostramos aquí es valioso, ya que permite obtener imágenes longitudinales in vivo de células trasplantadas en el cerebro de ratón. Este protocolo es especialmente útil para obtener información sobre la migración y la supervivencia del injerto en el mismo animal durante un período de tiempo.
Este procedimiento se puede aplicar a cualquier línea celular que exprese luciferasa trasplantada al cerebro de ratón. Sin embargo, la intensidad de la señal puede variar dependiendo de la profundidad del trasplante o la expresión de luciferasa en la línea celular respectiva. Demostrando el procedimiento estará Rebecca Weber, una excelente estudiante de doctorado en nuestro laboratorio.
Comience recolectando un vial de células de menos 150 grados Celsius de almacenamiento y transfiéralo al laboratorio. Transfiera rápidamente el vial a un baño de agua templado a 37 grados celsius durante dos o tres minutos hasta que los cristales de hielo se disuelvan. Luego, transfiera el vial al gabinete de bioseguridad y pipetee todo el contenido en un tubo cónico estéril de 15 mililitros.
Añadir nueve mililitros de PBS estéril y centrifugar a 300 G durante cinco minutos a temperatura ambiente. Retire el sobrenadante por aspiración sin perturbar el pellet y cuente las células antes del giro final utilizando un contador celular automatizado. Transportar al animal desde la cámara de inducción hasta el marco estereotáxico, manteniendo la anestesia con una máscara facial.
Aplique lubricante oftálmico para evitar que los ojos se sequen. Afeitar el cuero cabelludo del ratón con una maquinilla de afeitar eléctrica y desinfectar la piel con una solución de betadina al 5% con hisopos de algodón. Asegure la cabeza del ratón e inserte las barras para los oídos en el meato externo.
Perfore un orificio con un diámetro de dos a tres milímetros a través del cráneo con un taladro dental quirúrgico. Vuelva a suspender las células preparadas en el tubo y extraiga dos microlitros de suspensión celular en una jeringa. Coloque la jeringa sobre el sitio objetivo y mueva lentamente la aguja a la superficie de la duramadre y calcule las coordenadas de profundidad.
Haga doble clic en el icono del software Living Image y seleccione un ID de usuario de la lista desplegable. A continuación, haga clic en Inicializar en el Panel de control que aparece. En el software Living Image, marque las casillas Luminiscente y Fotografía en el Panel de control y seleccione Exposición automática.
Seleccione un campo de visión. Introduzca la altura del sujeto y seleccione la opción usar el enfoque de altura del sujeto. Configure manualmente los parámetros de filtrado, incluidos Binning grande, F/Stop, filtro de excitación bloqueado y filtro de emisión abierto.
Inyecte la luciferina por vía intraperitoneal y, después de cinco minutos, anestesia a los animales con un suministro continuo de isoflurano. Afeitar a los animales sedados en la región de la cabeza con una afeitadora de pelo convencional. Coloque al animal en la cámara de imágenes y comience a tomar imágenes 15 minutos después de la inyección de luciferina haciendo clic en Adquirir en el Panel de control.
Antes de trasplantar células progenitoras neurales en el cerebro de ratón, las células se probaron para una transducción exitosa mediante la expresión de EGFP in vitro. El trasplante exitoso fue confirmado por la presencia de la señal roja de luciferasa Firefly. Después del trasplante de 6.000 a 180.000 células en la corteza motora sensorial derecha del ratón, la señal de bioluminiscencia fue detectable en todas las concentraciones.
Las células sobrevivieron durante al menos cinco semanas después del trasplante. Las células trasplantadas fueron detectadas con éxito ex vivo en un análisis histológico posterior a través del reportero EGFP e inmunotinción con núcleos antihumanos. Es muy importante calcular cuidadosamente las coordenadas de inyección para evitar perder el sitio objetivo.
Y también, deje la jeringa en su lugar durante al menos cinco minutos después del trasplante para evitar cualquier reflujo. Después de las imágenes bioluminiscentes in vivo, el tejido cerebral se puede preparar para el análisis histológico, o las células trasplantadas se pueden aislar utilizando FACS y caracterizarse con tecnologías diferentes o mixtas. En general, esta técnica proporciona un seguimiento cuantitativo y continuo de las células trasplantadas en el cerebro, y se puede aplicar a una gran cantidad de enfermedades neurológicas, incluidos los accidentes cerebrovasculares y las lesiones cerebrales traumáticas.
