تسمح هذه الطريقة بإنتاج أنماط محددة من قبل المستخدم من الكائنات الحية الدقيقة داخل قناة الموائع الدقيقة. بمجرد أن يتم نقوشها ، يمكن مراقبة الكائنات الحية الدقيقة لتقييم فسيولوجيتها طويلة الأجل وتفاعلها مع الإنتاجية العالية. يتيح استخدام القوى الشعرية مسارا غير محدد للنقش ، والذي ينطبق عبر فئات مختلفة من المواد.
على سبيل المثال ، الجسيمات الغروية والبكتيريا. علاوة على ذلك ، فإنه يسمح بإنتاج صفائف كبيرة مع تحكم رائع في الترتيب المكاني للمواد ذات الاهتمام. حتى الآن ، اختبرنا وطبقنا الطريقة على الجسيمات الغروية والخلايا الميكروبية.
ونتيجة لذلك ، يمكن أن تجد تطبيقات في هندسة المواد والمجالات التي تتطلب تحليلا كميا أحادي الخلية مثل فحص الأدوية. للبدء ، قم بإعداد خليط PDMS عن طريق خلط المطاط الصناعي مع عامل الربط المتقاطع. ثم حرك الخليط بقوة لمزج المكونين بشكل موحد حتى تتشكل فقاعات الهواء ويبدو خليط PDMS غير شفاف.
الآن ، قم بإزالة الخليط في مجفف فراغ حتى تتم إزالة جميع فقاعات الهواء ويبدو الخليط شفافا مرة أخرى. للحصول على أرضية قالب بسماكة 400 ميكرومتر من رقاقة الموائع الدقيقة ، صب ثلاثة غرامات من الخليط على سيد السيليكون وضع سيد السيليكون على معطف دوار لتدوير معطف في 21 مرة G لمدة خمس ثوان و 54 مرة G لمدة 10 ثوان. Degas مرة أخرى لإزالة فقاعات الهواء المحاصرة كما هو موضح سابقا.
صب 20 غراما من خليط PDMS في القالب المطبوع ثلاثي الأبعاد لصنع القناة الدقيقة التي ستكون بمثابة سقف رقاقة الموائع الدقيقة وتفكيكها لمدة 30 دقيقة كما هو موضح سابقا. اخبز رقاقة السيليكون والقالب المطبوع ثلاثي الأبعاد عند 70 درجة مئوية لمدة ساعتين على الأقل ، ثم اقطع PDMS على طول الخطوط العريضة للقالب المطبوع ثلاثي الأبعاد وقشره. قطع PDMS مع شفرة حول القنوات الدقيقة ولكم الثقوب التي ستكون بمثابة مدخل ومخرج للقناة microfluidic.
الآن قم بقطع PDMS وقشره من سيد السيليكون وقطع طبقة PDMS إلى قطع أصغر بنفس أبعاد قنوات الموائع الدقيقة التي سيتم ربطها أعلى القوالب. افرك القوالب والقنوات الدقيقة بلطف باستخدام محلول منظف بنسبة 1٪ لمدة خمس دقائق ثم اشطفها بالماء منزوع الأيونات. بعد ذلك ، شطف القوالب والقنوات الدقيقة باستخدام الأيزوبروبانول ، قبل شطفها بالماء منزوع الأيونات.
الآن قم بتجفيف القوالب والقنوات الدقيقة في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقة واحدة مع الهواء المضغوط في شريط واحد. ضع القوالب والقنوات الدقيقة في منظف البلازما مع توجيه أسطح الترابط لأعلى. بعد تشغيل منظف البلازما ، تعالج البلازما القوالب والقنوات الدقيقة لمدة 40 ثانية ، ثم تخرجها من منظف البلازما وتربط على الفور القنوات الدقيقة أعلى القوالب.
قم بتخزين رقائق الموائع الدقيقة في فرن على درجة حرارة 70 درجة مئوية لمدة خمسة أيام لضمان استعادة PDMS الكارهة للماء. في يوم التجربة، اضبط الحاضنة الصندوقية على 37 درجة مئوية قبل عدة ساعات من التجربة، ثم قم بإعداد مضخة المحقنة والصفيحة الزجاجية المسخنة على مسرح المجهر، مع ضبط نفس درجة حرارة حاضنة الصندوق. قبل 90 دقيقة من التجربة ، ضع شريحة الموائع الدقيقة في وعاء مملوء بالإيثانول بنسبة 100٪ واغسل القناة بالإيثانول بنسبة 100٪ لمدة 10 دقائق على الأقل ، ثم ضع شريحة الموائع الدقيقة في مجفف فراغ و degas لمدة 30 دقيقة على الأقل.
الآن تبادل الإيثانول مع الماء المقطر وفراغ علاج رقاقة لمدة 30 دقيقة على الأقل. ضع رقاقة الموائع الدقيقة في الفرن على حرارة 70 درجة مئوية لمدة 10 دقائق لإزالة أي آثار للسائل المتبقي في القناة. ماصة واحدة ملليلتر من MOPS المتوسطة في قارورة جهاز طرد مركزي وإضافة 10 ميكرولتر من 0.132 فوسفات البوتاسيوم المولي.
Aliquot 100 ميكرولتر من الثقافة بين عشية وضحاها في قارورة أجهزة الطرد المركزي وأجهزة الطرد المركزي للثقافة في 2،300 مرة G لمدة دقيقتين. تخلص بلطف من السوبرناتانت لإعادة تعليق الكريات في ملليلتر واحد من MOPS الطازج المتوسط مع 0.015٪ من Tween 20 و 0.01٪ من فوسفات البوتاسيوم وتحميل التعليق البكتيري في حقنة ملليلتر واحد. لتأمين المحقنة واتصال الأنابيب، أدخل إبرة مباشرة في الأنابيب.
الآن قم بتركيب المحقنة على مضخة المحقنة وحقن التعليق في شريحة الموائع الدقيقة من خلال المدخل الموجود في الجزء العلوي من القناة حتى يغطي التعليق منطقة القالب بالفخاخ. اضبط مضخة المحقنة بمعدل تدفق يتراوح من 0.07 إلى 0.2 ميكرولتر في الدقيقة لسحب التعليق البكتيري ومراقبة عملية النقش عبر برنامج المجهر. بمجرد أن يتم نقش القالب بالخلايا ، قم بزيادة معدل تدفق السحب لإفراغ قناة الموائع الدقيقة بسرعة وغسلها ب LB الطازج الذي تم تفكيكه مسبقا لمدة 30 دقيقة على الأقل وتسخينه مسبقا عند 30 درجة مئوية.
الآن اضبط مضخة المحقنة بمعدل تدفق يبلغ ميكرولترين في الدقيقة لطرد القناة بلطف. بمجرد ملء القناة ، قم بزيادة معدل التدفق مرة أخرى. احصل على صور للبكتيريا النامية في التكبير المطلوب والفاصل الزمني.
ماصة 900 ميكرولتر من محلول مائي Tween 20 بنسبة 0.015٪ في قارورة جهاز طرد مركزي ثم ماصة 100 ميكرولتر من التعليق الغروي الأصلي فيها. قم بالطرد المركزي للتعليق عند 13،500 مرة G لمدة دقيقة واحدة واستبدل بلطف الفائق بمحلول Tween 20 المائي. قم بتحميل التعليق الغروي في حقنة ملليلتر واحدة وقم بتوصيل المحقنة بالشريحة من خلال أنابيب الموائع الدقيقة.
حقن التعليق في رقاقة الموائع الدقيقة من خلال المدخل الموجود داخل القسم المركزي في الجزء العلوي من القناة وادفع التعليق تدريجيا حتى يتم تغطية القالب. اسحب التعليق الغروي بمعدل تدفق يتراوح بين 0.07 و 0.2 ميكرولتر في الدقيقة وصور عملية النقش عبر برنامج المجهر. قم بزيادة معدل التدفق بمجرد وصول الغضروف المفصلي إلى نهاية القالب بسرعة.
تم استغلال هندسة القناة المستقيمة لنمط الخلايا المرحلية الثابتة لسلالة الإشريكية القولونية الفلورية التي ترسب 83٪ من الفخاخ التي تم تحليلها والتي تم تحليلها والتي تم تحليلها. استأنفت البكتيريا المنقوشة النمو في أوقات مختلفة في غضون 1.5 ساعة من الوقت الذي امتلأت فيه القناة ب LB الطازج. بمجرد استئناف النمو ، بدأت الخلايا البكتيرية المفردة في تكوين مستعمرات فردية توسعت حتى تشكلت طبقة سطحية وفقدت دقة الخلية الواحدة. أظهر التحليل الذي أجري على أكثر من 55000 فخ أن الدايمرات الخضراء والحمراء التي صنعتها جسيمتان قطرهما ميكرومتر وميكرومتر واحد تشكلت في 93٪ و 89٪ من الفخاخ التي تم تحليلها على التوالي.
وتشكلت أدوات تشذيب خضراء حمراء خضراء في 52٪ من الفخاخ. يمكن التحكم بدقة في المسافة بين الجسيمات المنقوشة عن طريق إجراء ترسبين في اتجاهين متعاكسين ، وبالتالي محاصرة هذه الجسيمات في الأطراف المقابلة لكل فخ. من المهم ضمان درجة حرارة موحدة عبر القالب لمنع التكثيف أثناء عملية النقش.
تحقيقا لهذه الغاية ، نضع لوحة زجاجية ساخنة أسفل القالب ونضعها في نفس درجة حرارة حاضنة الصندوق. يمكن استخدام هذه الطريقة في مجموعة متنوعة من الدراسات البيولوجية التي تنطوي على التحليل الكمي للخلية الواحدة. ميزة فريدة من نوعها هي أن طبيعتها الإنتاجية العالية التي تسمح بنقش الآلاف من الخلايا التي توفر إحصاءات كبيرة داخل نفس الساحة التجريبية.
