Este método permite produzir padrões definidos pelo usuário de microrganismos dentro de um canal microfluido. Uma vez padronizados, os microrganismos podem ser monitorados para avaliar sua fisiologia de longo prazo e interação com alto rendimento. O uso de forças capilares permite uma rota inespecífica para a padronização, que é aplicável em diferentes classes de materiais.
Por exemplo, partículas coloidais e bactérias. Além disso, permite produzir grandes matrizes com controle requintado do arranjo espacial do material de interesse. Até hoje, testamos e aplicamos o método em partículas coloidais e células microbianas.
Como resultado, ele pode encontrar aplicações em engenharia de materiais e campos que requerem análises quantitativas unicelulares, como a triagem de medicamentos. Para começar, prepare uma mistura de PDMS misturando o elastômero com seu agente de ligação cruzada. Em seguida, mexa a mistura vigorosamente para misturar os dois componentes uniformemente até que as bolhas de ar sejam formadas e a mistura PDMS pareça opaca.
Agora, desgas a mistura em um desiccador a vácuo até que todas as bolhas de ar sejam removidas e a mistura pareça transparente novamente. Para obter um piso de modelo de 400 micrômetros de espessura do chip microfluido, despeje três gramas da mistura no mestre do silício e coloque o mestre de silício em um revestimento de spin para girar o casaco a 21 vezes G por cinco segundos e 54 vezes G por 10 segundos. Degas novamente para remover as bolhas de ar presas como descrito anteriormente.
Despeje 20 gramas da mistura PDMS no molde impresso em 3D para fazer o microcanal que servirá como o teto do chip microfluido e degas-lo por 30 minutos como descrito anteriormente. Asse o wafer de silício e o molde impresso em 3D a 70 graus Celsius por pelo menos duas horas, depois corte o PDMS ao longo do contorno do molde impresso em 3D e retire-o. Corte o PDMS com uma lâmina ao redor dos microcanais e faça os orifícios que servirão de entrada e saída do canal microfluido.
Agora corte o PDMS e retire-o do mestre de silício e corte a camada PDMS em pedaços menores com as mesmas dimensões dos canais microfluidos que serão ligados em cima dos modelos. Esfregue suavemente os modelos e microcanais usando uma solução de detergente de 1% por cinco minutos e enxágue com água deionizada. Em seguida, enxágue os modelos e microcanais com isopropanol, antes de enxágüá-los com água deionizada.
Agora seque os modelos e microcanais à temperatura ambiente por um minuto com ar comprimido em uma barra. Coloque os modelos e os microcanais em um limpador de plasma com as superfícies de ligação voltadas para cima. Depois de ligar o limpador de plasma, o plasma trata os modelos e microcanais por 40 segundos, depois retire-os do limpador de plasma e ligue imediatamente os microcanais em cima dos modelos.
Armazene os chips microfluidos em um forno a 70 graus Celsius durante cinco dias para garantir a recuperação hidrofóbica do PDMS. No dia do experimento, coloque a incubadora da caixa a 37 graus Celsius várias horas antes do experimento, em seguida, configure a bomba de seringa e a placa de vidro aquecida no estágio do microscópio, configurando a mesma temperatura que a da incubadora da caixa. 90 minutos antes do experimento, coloque o chip microfluido em um navio cheio de 100% de etanol e lave o canal com 100% de etanol por pelo menos 10 minutos, depois coloque o chip microfluido em um desiccador de vácuo e degas por pelo menos 30 minutos.
Agora troque o etanol com água destilada e o vácuo trate o chip por pelo menos 30 minutos. Coloque o chip microfluido no forno a 70 graus Celsius por 10 minutos para remover quaisquer traços de líquido deixados no canal. Pipeta um mililitro de mops médio em um frasco de centrífugas e adicionar 10 microliters de 0,132 fosfato de potássio molar.
Alíquota de 100 microliters da cultura da noite para o dia no frasco de centrífugas e centrífuga da cultura a 2.300 vezes G por dois minutos. Descarte suavemente o supernatante para resuspensar a pelota em um mililitro de mops médio fresco com 0,015% de Tween 20 e 0,01% de fosfato de potássio e carregar a suspensão bacteriana em uma seringa mililitro. Para fixar a seringa e a conexão de tubulação, insira diretamente uma agulha na tubulação.
Agora monte a seringa na bomba de seringa e injete a suspensão no chip microfluido através da entrada localizada na parte upstream do canal até que a suspensão cubra a região do modelo com armadilhas. Defina a bomba de seringa a uma taxa de fluxo de 0,07 a 0,2 microlitros por minuto para retirar a suspensão bacteriana e monitorar o processo de padronização via software de microscópio. Uma vez que o modelo tenha sido padronizado com células, aumente a taxa de fluxo de retirada para esvaziar rapidamente o canal microfluido e lavá-lo com LB fresco que foi anteriormente desgaseado por pelo menos 30 minutos e pré-equipado a 30 graus Celsius.
Agora, coloque a bomba de seringa a uma taxa de fluxo de dois microliters por minuto para lavar suavemente o canal. Uma vez preenchido o canal, aumente novamente a vazão. Adquira imagens de bactérias em crescimento na ampliação desejada e intervalo de tempo.
Pipeta 900 microliters de uma solução aquosa 0,015%Tween 20 em um frasco de centrífuga e, em seguida, pipeta 100 microliters da suspensão coloidal original nele. Centrifugar a suspensão a 13.500 vezes G por um minuto e substituir suavemente o supernatante pela solução aquosa Tween 20. Carregue a suspensão coloidal em uma seringa de um mililitro e conecte a seringa ao chip através de tubos microfluidos.
Injete a suspensão no chip microfluídico através da entrada localizada dentro da seção central na parte upstream do canal e empurre gradualmente a suspensão até que o modelo seja coberto. Retire a suspensão coloidal a uma taxa de fluxo de 0,07 a 0,2 microlitros por minuto e imagem do processo de padronização via software de microscópio. Aumente a taxa de fluxo assim que o menisco chegar ao final do modelo rapidamente.
A geometria do canal reto foi explorada para padronizar células estacionárias em fases de uma cepa fluorescente de Escherichia coli depositando 83% das 5.000 armadilhas analisadas. As bactérias padronizadas retomaram o crescimento em diferentes horários dentro de 1,5 horas a partir de quando o canal estava cheio de LB fresco. Uma vez que o crescimento foi retomado, células bacterianas únicas começaram a formar colônias individuais que se expandiram até que uma camada superficial foi formada e a resolução de células únicas foi perdida. Análises realizadas em mais de 55.000 armadilhas mostraram que as partículas verde-vermelhas feitas por duas e um partículas de diâmetro de micrômetro foram formadas em 93% e 89% das armadilhas analisadas, respectivamente.
E aparadores verde-vermelho-verde foram formados em 52% das armadilhas. A distância entre partículas padronizadas pode ser precisamente controlada realizando dois depoimentos em direções opostas, prendendo tais partículas nas extremidades opostas de cada armadilha. É importante garantir a temperatura uniforme em todo o modelo para evitar a condensação durante o processo de padronização.
Para isso, colocamos uma placa de vidro aquecida por baixo do modelo e a colocamos na mesma temperatura da incubadora da caixa. Este método pode ser usado em uma variedade de estudos biológicos envolvendo análises quantitativas unicelulares. Uma vantagem única é que sua natureza de alto rendimento permite a padronização de milhares de células fornecendo grandes estatísticas dentro da mesma arena experimental.
