Этот метод позволяет получать определяемые пользователем паттерны микроорганизмов в микрофлюидном канале. После создания шаблона микроорганизмы можно контролировать, чтобы оценить их долгосрочную физиологию и взаимодействие с высокой пропускной способностью. Использование капиллярных сил позволяет создать неспецифический путь для моделирования, который применим к различным классам материалов.
Например, коллоидные частицы и бактерии. Более того, это позволяет производить большие массивы с изысканным контролем пространственного расположения интересующего материала. На сегодняшний день мы протестировали и применили метод на коллоидных частицах и микробных клетках.
В результате он может найти применение в материаловедении и областях, требующих количественного одноклеточного анализа, таких как скрининг лекарств. Для начала приготовьте смесь PDMS, смешав эластомер с его сшивающим агентом. Затем энергично перемешайте смесь, чтобы равномерно смешать два компонента, пока не образуются пузырьки воздуха и смесь PDMS не выглядит непрозрачной.
Теперь дегазируйте смесь в вакуумном осушителе до тех пор, пока все пузырьки воздуха не будут удалены и смесь снова не станет прозрачной. Чтобы получить шаблонный пол микрофлюидного чипа толщиной 400 микрометров, налейте три грамма смеси на кремниевый мастер и поместите кремниевого мастера на спин-коатер, чтобы раскрутить покрытие в 21 раз G в течение пяти секунд и 54 раза G в течение 10 секунд. Дега снова для удаления захваченных пузырьков воздуха, как описано ранее.
Вылейте 20 граммов смеси PDMS в 3D-печатную форму, чтобы сделать микроканал, который будет служить крышей микрофлюидного чипа, и дегазировать его в течение 30 минут, как описано ранее. Выпекайте кремниевую пластину и 3D-печатную форму при температуре 70 градусов Цельсия в течение не менее двух часов, затем вырежьте PDMS вдоль контура 3D-печатной формы и снимите ее. Вырежьте PDMS лезвием вокруг микроканалов и пробьете отверстия, которые будут служить входом и выходом микрофлюидного канала.
Теперь отрежьте PDMS и отклейте его от кремниевого мастера и разрежьте слой PDMS на более мелкие кусочки с теми же размерами микрофлюидных каналов, которые будут склеены поверх шаблонов. Аккуратно протрите шаблоны и микроканалы с помощью 1% моющего раствора в течение пяти минут, а затем промойте деионизированной водой. Далее промойте шаблоны и микроканалы изопропанолом, прежде чем промыть их деионизированной водой.
Теперь высушите шаблоны и микроканалы при комнатной температуре в течение одной минуты сжатым воздухом за один бар. Поместите шаблоны и микроканалы в плазменный очиститель со склеивающими поверхностями вверх. После включения плазмоочистителя плазменно обрабатывают шаблоны и микроканалы в течение 40 секунд, затем вынимают их из плазмоочистителя и сразу же связывают микроканалы поверх шаблонов.
Храните микрофлюидные чипсы в духовке при температуре 70 градусов Цельсия в течение пяти дней, чтобы обеспечить гидрофобное восстановление PDMS. В день эксперимента установите коробчатый инкубатор на 37 градусов цельсия за несколько часов до эксперимента, затем установите шприцевой насос и нагретую стеклянную пластину на ступень микроскопа, установив ту же температуру, что и у коробочного инкубатора. За 90 минут до эксперимента поместите микрофлюидный чип в сосуд, заполненный 100% этанолом, и промывайте канал 100%-ным этанолом в течение не менее 10 минут, затем поместите микрофлюидный чип в вакуумный осушитель и дегазируйте не менее чем на 30 минут.
Теперь замените этанол дистиллированной водой и обработайте чип в вакууме не менее 30 минут. Поместите микрофлюидный чипс в духовку при температуре 70 градусов Цельсия на 10 минут, чтобы удалить любые следы жидкости, оставшиеся в канале. Пипетка один миллилитр среды MOPS во флакон центрифуги и добавление 10 микролитров 0,132 молярного фосфата калия.
Aliquot 100 микролитров ночной культуры в центрифугу во флакон и центрифугируют культуру в 2, 300 раз G в течение двух минут. Осторожно выбросьте супернатант для повторного суспендирования гранулы в одном миллилитре свежей среды MOPS с 0,015% Tween 20 и 0,01% фосфата калия и загрузите бактериальную суспензию в один миллилитр шприц. Чтобы закрепить шприц и соединение трубки, непосредственно вставьте иглу в трубку.
Теперь установите шприц на шприцевом насосе и впрыскивайте суспензию в микрофлюидную стружку через входное отверстие, расположенное в верхней части канала, пока подвеска не закроет область шаблона ловушками. Установите шприцевой насос со скоростью потока от 0,07 до 0,2 микролитров в минуту, чтобы извлечь бактериальную суспензию и контролировать процесс моделирования с помощью программного обеспечения микроскопа. После того, как шаблон был сформирован с ячейками, увеличьте скорость потока вывода, чтобы быстро опорожнить микрофлюидный канал и промыть его свежим LB, который ранее дегазировался в течение не менее 30 минут и предварительно расплавлялся при 30 градусах Цельсия.
Теперь установите шприцевой насос со скоростью потока два микролитра в минуту, чтобы аккуратно промыть канал. После того, как канал будет заполнен, снова увеличьте скорость потока. Получайте изображения растущих бактерий при желаемом увеличении и временном интервале.
Пипетка 900 микролитров 0,015%Tween 20 водного раствора в центрифугу флакона, а затем пипетка 100 микролитров исходной коллоидной суспензии в него. Центрифугируют суспензию в 13 500 раз G в течение одной минуты и осторожно заменяют супернатант водным раствором Tween 20. Загрузите коллоидную суспензию в один миллилитр шприц и подключите шприц к чипу через микрофлюидную трубку.
Впрыскивайте суспензию в микрофлюидную стружку через входное отверстие, расположенное в центральной секции в верхней части канала, и постепенно нажимайте на подвеску до тех пор, пока шаблон не будет покрыт. Извлеките коллоидную суспензию со скоростью потока от 0,07 до 0,2 микролитра в минуту и визуализируйте процесс моделирования с помощью программного обеспечения микроскопа. Увеличьте скорость потока, как только мениск быстро достигнет конца шаблона.
Геометрия прямого канала была использована для построения стационарных фазированных клеток флуоресцентной деформации кишечной палочки, откладывающей 83% из 5000 проанализированных ловушек. Узорчатые бактерии возобновляли рост в разное время в течение 1,5 часов с момента, когда канал был заполнен свежим LB. Как только рост был возобновлен, одиночные бактериальные клетки начали образовывать отдельные колонии, которые расширялись до тех пор, пока не был сформирован поверхностный слой и разрешение одной клетки не было потеряно. Анализ, проведенный более чем 55 000 ловушек, показал, что зелено-красные димеры, изготовленные частицами диаметром два и один микрометр, образовались в 93% и 89% проанализированных ловушек соответственно.
А зелено-красно-зеленые триммеры образовались в 52% ловушек. Расстояние между узорчатыми частицами можно точно контролировать, выполняя два осаждения в противоположных направлениях, таким образом захватывая такие частицы на противоположных концах каждой ловушки. Важно обеспечить равномерную температуру по всему шаблону, чтобы предотвратить конденсацию в процессе моделирования.
Для этого мы помещаем под шаблон нагретую стеклянную пластину и устанавливаем ее при той же температуре, что и бокс-инкубатор. Этот метод может быть использован в различных биологических исследованиях, включающих количественный одноклеточный анализ. Уникальным преимуществом является его высокая пропускная способность, которая позволяет моделировать тысячи клеток, обеспечивая большую статистику в пределах одной экспериментальной арены.
