Este método permite producir patrones de microorganismos definidos por el usuario dentro de un canal microfluídico. Una vez modelados, los microorganismos pueden ser monitoreados para evaluar su fisiología a largo plazo y su interacción con un alto rendimiento. El uso de fuerzas capilares permite una ruta no específica para el modelado, que es aplicable a diferentes clases de materiales.
Por ejemplo, partículas coloidales y bacterias. Además, permite producir grandes matrices con un control exquisito de la disposición espacial del material de interés. Hasta la fecha, probamos y aplicamos el método en partículas coloidales y células microbianas.
Como resultado, puede encontrar aplicaciones en ingeniería de materiales y campos que requieren análisis cuantitativo de una sola célula, como la detección de drogas. Para comenzar, prepare una mezcla de PDMS mezclando el elastómero con su agente reticulante. Luego revuelva la mezcla vigorosamente para mezclar los dos componentes de manera uniforme hasta que se formen burbujas de aire y la mezcla de PDMS se vea opaca.
Ahora, desgasifica la mezcla en un desecador al vacío hasta que se eliminen todas las burbujas de aire y la mezcla se vea transparente nuevamente. Para obtener un piso de plantilla de 400 micrómetros de espesor del chip microfluídico, vierta tres gramos de la mezcla en el maestro de silicio y coloque el maestro de silicio en un recubrimiento de espín para girar la capa a 21 veces G durante cinco segundos y 54 veces G durante 10 segundos. Desgasificar nuevamente para eliminar las burbujas de aire atrapadas como se describió anteriormente.
Vierta 20 gramos de la mezcla PDMS en el molde impreso en 3D para hacer el microcanal que servirá como techo del chip microfluídico y desgasificarlo durante 30 minutos como se describió anteriormente. Hornea la oblea de silicio y el molde impreso en 3D a 70 grados centígrados durante al menos dos horas, luego corta el PDMS a lo largo del contorno del molde impreso en 3D y pégalo. Corte el PDMS con una cuchilla alrededor de los microcanales y perfore los orificios que servirán como entrada y salida del canal microfluídico.
Ahora corte el PDMS y péguelo del maestro de silicio y corte la capa de PDMS en trozos más pequeños con las mismas dimensiones de los canales microfluídicos que se unirán en la parte superior de las plantillas. Frote suavemente las plantillas y los microcanales con una solución de detergente al 1% durante cinco minutos y luego enjuague con agua desionizada. A continuación, enjuague las plantillas y microcanales con isopropanol, antes de enjuagarlos con agua desionizada.
Ahora seque las plantillas y los microcanales a temperatura ambiente durante un minuto con aire comprimido en una barra. Coloque las plantillas y los microcanales en un limpiador de plasma con las superficies de unión hacia arriba. Después de encender el limpiador de plasma, el plasma trata las plantillas y los microcanales durante 40 segundos, luego sácalos del limpiador de plasma e inmediatamente une los microcanales en la parte superior de las plantillas.
Guarde los chips microfluídicos en un horno a 70 grados Centígrados durante cinco días para garantizar la recuperación hidrofóbica del PDMS. El día del experimento, ajuste la incubadora de caja a 37 grados centígrados varias horas antes del experimento, luego configure la bomba de jeringa y la placa de vidrio calentada en el escenario del microscopio, estableciendo la misma temperatura que la de la incubadora de caja. 90 minutos antes del experimento, coloque el chip microfluídico en un recipiente lleno de etanol al 100% y enjuague el canal con etanol al menos 100 minutos, luego coloque el chip microfluídico en un desecador al vacío y desgasifique durante al menos 30 minutos.
Ahora intercambie el etanol con agua destilada y trate al vacío el chip durante al menos 30 minutos. Coloque el chip microfluídico en el horno a 70 grados centígrados durante 10 minutos para eliminar cualquier rastro de líquido que quede en el canal. Pipetee un mililitro de medio MOPS en un vial de centrífuga y agregue 10 microlitros de fosfato de potasio molar 0.132.
Alícuota 100 microlitros del cultivo nocturno en el vial de la centrífuga y centrífuga el cultivo a 2,300 veces G durante dos minutos. Deseche suavemente el sobrenadante para resuspender el pellet en un mililitro de medio MOPS fresco con 0.015% de Tween 20 y 0.01% de fosfato de potasio y cargue la suspensión bacteriana en una jeringa de un mililitro. Para asegurar la jeringa y la conexión del tubo, inserte directamente una aguja en el tubo.
Ahora monte la jeringa en la bomba de la jeringa e inyecte la suspensión en el chip microfluídico a través de la entrada ubicada en la parte aguas arriba del canal hasta que la suspensión cubra la región de la plantilla con trampas. Ajuste la bomba de la jeringa a un caudal de 0,07 a 0,2 microlitros por minuto para retirar la suspensión bacteriana y supervisar el proceso de modelado a través del software del microscopio. Una vez que la plantilla haya sido modelada con celdas, aumente la tasa de flujo de extracción para vaciar rápidamente el canal microfluídico y enjuáguelo con LB fresco que se desgasificó previamente durante al menos 30 minutos y se precalenció a 30 grados centígrados.
Ahora ajuste la bomba de jeringa a un caudal de dos microlitros por minuto para enjuagar suavemente el canal. Una vez que el canal se ha llenado, aumente nuevamente el caudal. Adquiera imágenes de bacterias en crecimiento en el aumento deseado y el intervalo de tiempo.
Pipetear 900 microlitros de una solución acuosa 0.015%Tween 20 en un vial de centrífuga y luego pipetear 100 microlitros de la suspensión coloidal original en él. Centrifugar la suspensión a 13, 500 veces G durante un minuto y reemplazar suavemente el sobrenadante con la solución acuosa Tween 20. Cargue la suspensión coloidal en una jeringa de un mililitro y conecte la jeringa al chip a través de tubos microfluídicos.
Inyecte la suspensión en el chip microfluídico a través de la entrada ubicada dentro de la sección central en la parte aguas arriba del canal y empuje gradualmente la suspensión hasta que se cubra la plantilla. Retire la suspensión coloidal a un caudal de 0,07 a 0,2 microlitros por minuto y tome una imagen del proceso de modelado a través del software del microscopio. Aumente el caudal una vez que el menisco llegue al final de la plantilla rápidamente.
La geometría del canal recto se explotó para modelar células estacionarias en fase de una cepa fluorescente de Escherichia coli depositando el 83% de las 5.000 trampas analizadas. Las bacterias con patrones reanudaron el crecimiento en diferentes momentos dentro de 1.5 horas desde que el canal se llenó con LB fresco. Una vez que se reanudó el crecimiento, las células bacterianas individuales comenzaron a formar colonias individuales que se expandieron hasta que se formó una capa superficial y se perdió la resolución de una sola célula. El análisis realizado en más de 55,000 trampas mostró que los dímeros verde-rojos hechos por partículas de dos y un micrómetro de diámetro se formaron en el 93% y el 89% de las trampas analizadas, respectivamente.
Y se formaron recortadores verde-rojo-verde en el 52% de las trampas. La distancia entre las partículas modeladas se puede controlar con precisión realizando dos deposiciones en direcciones opuestas, atrapando así dichas partículas en los extremos opuestos de cada trampa. Es importante garantizar una temperatura uniforme en toda la plantilla para evitar la condensación durante el proceso de modelado.
Con este fin, colocamos una placa de vidrio calentada debajo de la plantilla y la colocamos a la misma temperatura que la incubadora de cajas. Este método se puede utilizar en una variedad de estudios biológicos que involucran análisis cuantitativos de una sola célula. Una ventaja única es su naturaleza de alto rendimiento que permite el modelado de miles de células que proporcionan grandes estadísticas dentro de la misma arena experimental.
