هذا البروتوكول مهم لأنه يمكن استخدامه لتصور واستجواب مسار كاسباز الالتهابي على المستوى الجزيئي في الخلايا الحية في حالة مرضية معينة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن استخدامها لتحديد المكونات والمتطلبات وتوطين مجمعات تنشيط كاسباز الالتهابية في الخلايا المناعية الأولية. مع التحسينات الطفيفة ، يمكن تكييف هذه الطريقة مع الخلايا الأولية الأخرى ومجموعة من البروتينات التي يتم تنشيطها عن طريق قلة القلة ، ولا يقتصر تطبيقها على المنهجيات المجهرية.
أولا ، قم بشفط الوسائط من البلاعم المتمايزة تماما على أطباق 10 سم واغسل الطبقة الأحادية للخلية بوسط RPMI-1640 الدافئ الخالي من المصل ، وإزالة جميع الوسائط تماما. حصاد الخلايا عن طريق إضافة ملليلترين من محلول التربسين-EDTA الدافئ بنسبة 0.25٪ لكل طبق 10 سم. قم بسحب التربسين-EDTA بلطف لأعلى ولأسفل على الطبق بأكمله باستخدام ماصة دقيقة P-1000 ، ثم انقل التعليق إلى أنبوب مخروطي 15 ملليلتر يحتوي على خمسة ملليلترات من وسط الثقافة الكاملة الدافئة.
تحقق من انفصال الخلايا تحت مجهر حقل ساطع وافصلها مرة أخرى إذا لزم الأمر. شفط الوسط وإعادة تعليق الخلايا في 10 ملليلتر من 1X PBS معقمة قبل تسخينها إلى 37 درجة مئوية. ثم خذ 20 ميكرولتر أليكوت لتحديد رقم الخلية باستخدام مقياس الدم.
خذ مرة إلى مرتين 10 إلى الخلايا الخامسة لكل عملية نقل وضعها في أنبوب 15 ملليلتر. أحضر إلى الحجم النهائي من 15 ملليلتر مع PBS المعقم 1X المسخن مسبقا. قم بشفط PBS وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى لمدة دقيقة واحدة عند 250 × جم.
قم بإزالة أي PBS متبقية من حبيبة الخلية باستخدام ماصة دقيقة P-200. خذ أنبوب ميكروبوبي معقم سعة 1.5 ملليلتر لكل عملية نقل وأضف بلازميدات المراسل وبلازميدات BiFC المناسبة في غطاء المحرك. ضع محطة الماصة والجهاز والنصائح وأنابيب الكهربية والماصة في غطاء تدفق صفائحي معقم.
قم بتوصيل وتشغيل جهاز nucleofection. أدخل معلمات التحويل في شاشة بدء التشغيل المعروضة. اضغط على الجهد ، وأدخل 1000 ، واضغط على تم لضبطه على 1000 فولت.
اضغط على العرض، وأدخل 40، واضغط على تم لضبط النبض على 40 مللي ثانية. أخيرا ، اضغط على Pulses ، وأدخل 2 ، واضغط على Done لتعيين عدد النبضات الكهربائية إلى 2. خذ أحد أنابيب الكهربية واملأه بثلاثة ملليلتر من العازل الكهربائي E في درجة حرارة الغرفة.
أدخل أنبوب الكهربية في حامل الماصة في محطة الماصة، مما يضمن أن القطب الكهربائي الموجود على جانب الأنبوب مواجه للداخل ويسمع صوت نقرة عند إدخال الأنبوب. خذ حبيبة الخلية وأضف 10 ميكرولترات من المخزن المؤقت R لإعادة التعليق المسخن مسبقا لكل واحد إلى مرتين 10 إلى الخلايا الخامسة ، واخلطها بلطف مع ماصة دقيقة P-20. أضف 10 ميكرولترات من تعليق الخلية إلى كل أنبوب نقل واخلطها بلطف مع ماصة دقيقة P-20.
أدخل طرفا في الماصة عن طريق الضغط على زر الضغط على المحطة الثانية ، مما يضمن أن المشبك يلتقط تماما جذع المكبس المتصاعد في الطرف. بعد ذلك ، اضغط على زر الضغط الموجود على الماصة إلى المحطة الأولى واغمس في الأنبوب الأول الذي يحتوي على خليط الحمض النووي للخلية أو البلازميد لشفط العينة. أدخل الماصة مع العينة بعناية فائقة في حامل الماصة، مما يضمن نقر الماصة ووضعها بشكل مناسب.
اضغط على زر البدء على الشاشة التي تعمل باللمس وانتظر حتى يتم تسليم النبضات الكهربائية. قم بإزالة الماصة ببطء من المحطة وأضف على الفور تعليق الخلية المنقول إلى البئر المقابل مع الوسط الخالي من المضادات الحيوية الذي تم تسخينه مسبقا عن طريق الضغط ببطء على زر الضغط على المحطة الأولى. هز الصفيحة بلطف بخلايا معبرة واحتضنها لمدة ساعة إلى ثلاث ساعات في حاضنة زراعة الأنسجة الرطبة ، ثم أضف 200 ميكرولتر من وسط الثقافة المسخن مسبقا إلى كل بئر.
ضع الطبق في الحاضنة واسمح ب 24 ساعة على الأقل للتعبير الجيني. في اليوم التالي ، افحص صلاحية الخلية وكفاءة النقل باستخدام مجهر epifluorescence. قم بإزالة الوسائط من الخلايا بعناية باستخدام ماصة دقيقة P-1000 وأضف 500 ميكرولتر من محلول التحفيز أسفل جانب البئر.
لتشغيل آبار التحكم غير المعالجة ، أضف وسيطا للتصوير بدون الحافز. لتصور الخلايا باستخدام مجهر epifluorescence أو مجهر بؤري ، قم بتشغيل المجهر ومصدر الضوء الفلوري باتباع التعليمات. حدد الهدف 10 مرات أو 20 مرة وضع طبق الثقافة على مسرح المجهر.
ابحث عن الخلايا الموجودة تحت مرشح 568 نانومتر باستخدام قطعة العين. والتركيز على الخلايا المعبرة عن الخلايا الحمراء للمراسل. عد جميع الخلايا الحمراء في المجال البصري.
أثناء وجودك في نفس المجال المرئي ، قم بالتغيير إلى مرشحات 488 أو 512 ، قم بحساب عدد الخلايا الحمراء الخضراء أيضا. احسب ما لا يقل عن 100 خلية حمراء من ثلاثة حقول على الأقل. احسب النسبة المئوية للخلايا المنقولة إيجابية الزهرة لكل مجال بصري ومتوسط النسب المئوية الناتجة لكل علاج بشكل جيد للحصول على الانحراف المعياري.
لتصوير الخلايا باستخدام مجهر epifluorescence أو مجهر بؤري ، تصور الصورة الحية للخلايا على شاشة الكمبيوتر كما حصلت عليها الكاميرا. قم بضبط التركيز البؤري وموضع الخلايا باستخدام عجلة التحكم في عصا التحكم والتركيز. اضبط النسبة المئوية لطاقة الليزر ووقت التعرض لليزر 512 نانومتر أو 488 نانومتر و568 نانومتر ، بحيث تبدو الإشارة في الصورة جيدة دون تشبع.
قم بتشغيل الالتقاط المباشر وفحص الصورة الناتجة، مما يضمن رؤية ذروة مميزة لكل طابق في الرسم البياني للشاشة لكلتا القناتين. أثناء تصور الصورة الحية للخلايا، التقط صورا تمثيلية متعددة لحقل يحتوي على خلية واحدة أو أكثر تعبر عن مراسل mCherry أو dsRedmito لكل بئر من اللوحة. أظهرت الخلايا الوحيدة الإيجابية المختارة CD-14 المحتضنة مع GM-CSF لمدة سبعة أيام تغيرات في مورفولوجيا الخلية على مدار فترة التمايز ، حيث انتقلت من خلايا التعليق الكروية إلى المغزل والمرتبطة بالكامل ، وأخيرا ، إلى خلايا أكثر انتشارا عند تمييزها بالكامل.
تم نقل الخلايا المتمايزة بالكامل مع أزواج كاسباز BiFC VC و VN جنبا إلى جنب مع المراسل البلازميد dsRedmito ، والذي تم استخدامه لتسمية الخلايا العابرة. لم تظهر الخلايا غير المعالجة أي تألق فينوس. وفي الخلايا المعالجة بالنيجريسين ، ظهر caspase-1 BiFC كثقب واحد مع الشكل النموذجي لبقع ASC.
أظهر القياس الكمي ل MDM الإيجابي لكوكب الزهرة أن أعلى نسبة مئوية من caspase-1 BiFC شوهدت في مجموعة علاج LPS بالإضافة إلى nigericin. في المعايرة بالتحليل الحجمي للكاسباز-1 و 4 و 5 أزواج مؤيدة ل BiFC ، نتجت أعلى نسبة من الخلايا الإيجابية لكوكب الزهرة عن 400 و 500 و 1000 نانوغرام من البلازميد العابر ، على التوالي. أظهرت الصور البؤرية التي تم الحصول عليها بهدف 20 مرة لحقل من الخلايا بعد 24 ساعة من التحويل أن الخلايا العابرة غير المعالجة قابلة للحياة لأن الميتوكوندريا سليمة.
بعد العلاج بالهيم ، يظهر مركب caspase-1 كثقب أخضر واحد مشابه لتلك التي يسببها nigericin. تذكر تجنب الظروف القاسية والتلاعب المفرط بالخلايا أثناء التمايز والنقل والعلاج لأنه يمكن أن يؤدي إلى تنشيط تلقائي ومستويات خلفية عالية من تنشيط كاسباز.
