Este protocolo é significativo porque pode ser usado para visualizar e interrogar a via de caspase inflamatória a nível molecular em células vivas em um determinado estado de doença. A principal vantagem dessa técnica é que ela pode ser usada para identificar os componentes, requisitos e localização dos complexos de ativação inflamatória de caspase em células imunes primárias. Com pequenas otimizações, este método pode ser adaptado a outras células primárias e uma gama de proteínas ativadas pela oligomerização, e sua aplicabilidade não se limita a metodologias microscópicas.
Primeiro, aspire a mídia de macrófagos totalmente diferenciados em pratos de 10 centímetros e lave a monocamada celular com meio RPMI-1640 livre de soro quente, removendo toda a mídia completamente. Colher as células adicionando dois mililitros de solução de trypsin-EDTA 0,25% quente por prato de 10 centímetros. Pipeta suavemente o trypsin-EDTA para cima e para baixo sobre todo o prato com uma micropipette P-1000, em seguida, transfira a suspensão para um tubo cônico de 15 mililitros contendo cinco mililitros de meio de cultura completa quente.
Verifique se há desprendimento celular sob um microscópio de campo brilhante e desprende novamente, se necessário. Aspire o médio e resuspenque as células em 10 mililitros de PBS estéreis de 1X pré-aquecidos a 37 graus Celsius. Em seguida, tome uma alíquota de 20 microliter para determinar o número da célula usando um hemócito.
Pegue de uma a duas vezes 10 a 5 células por transfecção e coloque-as em um tubo de 15 mililitros. Leve a um volume final de 15 mililitros com PBS estéril 1X pré-aquecido. Aspire o PBS e centrífuga mais uma vez por um minuto a 250 x g.
Remova qualquer PBS residual da pelota celular usando uma micropipette P-200. Pegue um microtubo estéril de 1,5 mililitro por transfecção e adicione o plasmídeo de repórter apropriado e plasmídeos BiFC caspase no capô. Coloque a estação de pipeta, dispositivo, pontas, tubos de eletroporação e pipeta em uma coifa de fluxo laminar estéril.
Conecte-se e ligue o dispositivo de nucleofecção. Digite os parâmetros de transeção na tela de inicialização exibida. Pressione a Voltagem, digite 1000 e pressione em Done para configurá-la em 1000 volts.
Pressione a Largura, digite 40 e pressione "Feito" para definir o pulso em 40 milissegundos. Por fim, pressione os pulsos, digite 2 e pressione o Feito para definir o número de pulsos elétricos para 2. Pegue um dos tubos de eletroporação e encha-o com três mililitros de tampão eletrolítico E à temperatura ambiente.
Insira o tubo de eletroporação no suporte da pipeta na estação pipeta, garantindo que o eletrodo na lateral do tubo esteja voltado para dentro e um som de clique seja ouvido quando o tubo é inserido. Pegue a pelota celular e adicione 10 microliters de tampão R de resuspensão pré-aquecida para cada uma a duas vezes 10 às quintas células, e misture suavemente com uma micropipette P-20. Adicione 10 microlitadores da suspensão celular a cada tubo de transfecção e misture delicadamente com uma micropipette P-20.
Insira uma ponta na pipeta pressionando o botão de pressão para a segunda parada, garantindo que o grampo pegue completamente a haste de montagem do pistão na ponta. Em seguida, pressione o botão de apertar a pipeta até a primeira parada e mergulhe no primeiro tubo contendo mistura de DNA celular ou plasmídeo para aspirar a amostra. Insira a pipeta com a amostra com muito cuidado no suporte da pipeta, garantindo que a pipeta clique e seja colocada adequadamente.
Pressione a tela de toque e espere até que os pulsos elétricos sejam entregues. Remova lentamente a pipeta da estação e adicione imediatamente a suspensão celular transctoida no poço correspondente com o meio pré-aquecido sem antibióticos pressionando lentamente o botão de pressão para a primeira parada. Balance suavemente a placa com células transectadas e incubar por uma a três horas em uma incubadora de cultura tecidificada, em seguida, adicione 200 microliters de meio de cultura pré-aquecido para cada poço.
Coloque o prato na incubadora e deixe pelo menos 24 horas para a expressão genética. No dia seguinte, inspecione a viabilidade celular e a eficiência da transfecção usando um microscópio de epifluorescência. Remova a mídia das células cuidadosamente com uma micropipette P-1000 e adicione 500 microliters da solução de estímulo ao lado do poço.
Para executar poços de controle não tratados, adicione um meio de imagem sem o estímulo. Para visualizar as células usando uma epifluorescência ou microscópio confocal, ligue o microscópio e a fonte de luz fluorescente seguindo as instruções. Selecione o objetivo de 10 ou 20 vezes e coloque o prato de cultura no palco do microscópio.
Encontre células sob o filtro de 568 nanômetros com a peça do olho. E concentre-se nas células expressando as células vermelhas do repórter. Conte todas as células vermelhas no campo visual.
Enquanto no mesmo campo visual, mude para os filtros 488 ou 512, conte o número de células vermelhas que também são verdes. Conte pelo menos 100 células vermelhas de três campos mínimos. Calcule a porcentagem de células transectadas positivas de Vênus por campo visual e média das porcentagens resultantes de cada tratamento bem para obter o desvio padrão.
Para visualizar as células usando uma epifluorescência ou microscópio confocal, visualize a imagem ao vivo das células na tela do computador, conforme adquirido pela câmera. Ajuste bem o foco e a posição das células usando o controle de joystick e a roda de foco. Defina a porcentagem de potência laser e o tempo de exposição para os lasers de 512 nanômetros ou 488 nanômetros e 568 nanômetros, de modo que o sinal na imagem pareça bom sem saturação.
Ligue a captura ao vivo e examine a imagem resultante, garantindo que um pico distinto seja visto para cada andar nos histogramas de exibição para ambos os canais. Ao visualizar a imagem ao vivo das células, pegue várias imagens representativas de um campo que contém uma ou mais células expressando o repórter mCherry ou dsRedmito para cada poço da placa. Os monócitos positivos cd-14 selecionados incubados com GM-CSF por sete dias mostraram alterações na morfologia celular ao longo do período de diferenciação, indo de células de suspensão esféricas para spindly e totalmente ligadas, e por último, a células mais difundidas quando totalmente diferenciadas.
Células totalmente diferenciadas foram transectadas com os pares caspase BiFC VC e VN, juntamente com o repórter plasmid dsRedmito, que foi usado para rotular as células transectadas. Células não tratadas não mostraram fluorescência de Vênus. E nas células tratadas com níger, o Caspase-1 BiFC apareceu como um único punctum com a forma típica de manchas ASC.
A quantitação do MDM venus positivo mostrou que a maior porcentagem de caspase-1 BiFC é vista no grupo de tratamento LPS mais nigericin. Na titulação plasmida de caspase-1, 4 e 5 pares pró-BiFC, a maior porcentagem de células positivas de Vênus resultou de 400, 500 e 1.000 nanogramas de plasmídeos transectados, respectivamente. Imagens confocal obtidas com um objetivo 20 vezes objetivo de um campo de células 24 horas após a transeção mostraram que as células transectadas não tratadas são viáveis à medida que as mitocôndrias estão intactas.
Após o tratamento com heme, o complexo caspase-1 aparece como um único punctum verde semelhante ao induzido pela nigericina. Lembre-se de evitar condições severas e manipulação excessiva das células durante a diferenciação, transfecção e tratamento, pois pode resultar em uma ativação espontânea e altos níveis de fundo de ativação de caspase.
