Este protocolo es significativo porque se puede utilizar para visualizar e interrogar la vía de la caspasa inflamatoria a nivel molecular en células vivas en un estado de enfermedad particular. La principal ventaja de esta técnica es que se puede utilizar para identificar los componentes, los requisitos y la localización de los complejos de activación de la caspasa inflamatoria en las células inmunes primarias. Con optimizaciones menores, este método se puede adaptar a otras células primarias y a una gama de proteínas activadas por oligomerización, y su aplicabilidad no se limita a metodologías microscópicas.
Primero, aspire los medios de macrófagos totalmente diferenciados en platos de 10 centímetros y lave la monocapa celular con un medio RPMI-1640 libre de suero caliente, eliminando todos los medios por completo. Cosecha las células agregando dos mililitros de solución de tripsina-EDTA al 0,25% caliente por plato de 10 centímetros. Pipetee suavemente la tripsina-EDTA hacia arriba y hacia abajo sobre todo el plato con una micropipeta P-1000, luego transfiera la suspensión a un tubo cónico de 15 mililitros que contenga cinco mililitros de medio de cultivo completo caliente.
Compruebe si hay desprendimiento celular bajo un microscopio de campo brillante y desconéctese nuevamente si es necesario. Aspire el medio y resuspenda las células en 10 mililitros de PBS estéril 1X precalentado a 37 grados Centígrados. Luego tome una alícuota de 20 microlitros para determinar el número de células usando un hemocitómetro.
Tome de una a dos veces 10 a la quinta célula por transfección y colóquelas en un tubo de 15 mililitros. Llevar a un volumen final de 15 mililitros con PBS estéril 1X precalentado. Aspirar el PBS y centrifugar una vez más durante un minuto a 250 x g.
Retire cualquier PBS residual del pellet celular usando una micropipeta P-200. Tome un microtubo estéril de 1,5 mililitros por transfección y agregue el plásmido reportero y los plásmidos BiFC caspasa apropiados en la capucha. Coloque la estación de pipeta, el dispositivo, las puntas, los tubos de electroporación y la pipeta en una campana de flujo laminar estéril.
Conecte y encienda el dispositivo de nucleofection. Introduzca los parámetros de transección en la pantalla de inicio que se muestra. Presione Voltaje, ingrese 1000 y presione Listo para configurarlo a 1000 voltios.
Presione Ancho, ingrese 40 y presione Listo para establecer el pulso en 40 milisegundos. Por último, presione Pulsos, ingrese 2 y presione Listo para establecer el número de pulsos eléctricos en 2. Tome uno de los tubos de electroporación y llénelo con tres mililitros de tampón electrolítico E a temperatura ambiente.
Inserte el tubo de electroporación en el soporte de pipeta en la estación de pipeta, asegurándose de que el electrodo en el lado del tubo esté orientado hacia adentro y se escuche un sonido de clic cuando se inserta el tubo. Tome el pellet celular y agregue 10 microlitros de tampón R de resuspensión R precalentado para cada una o dos veces 10 a la quinta celda, y mezcle suavemente con una micropipeta P-20. Agregue 10 microlitros de la suspensión celular a cada tubo de transfección y mezcle suavemente con una micropipeta P-20.
Inserte una punta en la pipeta presionando el botón pulsador hasta el segundo tope, asegurándose de que la abrazadera recoja completamente el vástago de montaje del pistón en la punta. A continuación, presione el botón de la pipeta hasta la primera parada y sumérjase en el primer tubo que contiene la mezcla de ADN celular o plásmido para aspirar la muestra. Inserte la pipeta con la muestra con mucho cuidado en el soporte de la pipeta, asegurándose de que la pipeta haga clic y se coloque correctamente.
Presione start en la pantalla táctil y espere hasta que se entreguen los pulsos eléctricos. Retire lentamente la pipeta de la estación e inmediatamente agregue la suspensión de células transectadas en el pozo correspondiente con el medio libre de antibióticos precalentado presionando lentamente el botón hasta la primera parada. Balancee suavemente la placa con células transectadas e incube durante una a tres horas en una incubadora de cultivo de tejido humidificado, luego agregue 200 microlitros de medio de cultivo precalentado a cada pozo.
Coloque el plato en la incubadora y espere al menos 24 horas para la expresión génica. Al día siguiente, inspeccione la viabilidad celular y la eficiencia de la transfección utilizando un microscopio de epifluorescencia. Retire los medios de las células con cuidado con una micropipeta P-1000 y agregue 500 microlitros de la solución de estímulo por el lado del pozo.
Para ejecutar pozos de control no tratados, agregue un medio de imágenes sin el estímulo. Para visualizar las células usando un microscopio de epifluorescencia o confocal, encienda el microscopio y la fuente de luz fluorescente siguiendo las instrucciones. Seleccione el objetivo 10 veces o 20 veces y coloque el plato de cultivo en el escenario del microscopio.
Encuentra células debajo del filtro de 568 nanómetros con el ocular. Y concéntrese en las células que expresan los glóbulos rojos reporteros. Cuente todos los glóbulos rojos en el campo visual.
Mientras esté en el mismo campo visual, cambie a los filtros 488 o 512, cuente el número de glóbulos rojos que también son verdes. Cuente al menos 100 glóbulos rojos de un mínimo de tres campos. Calcule el porcentaje de células transectadas positivas para Venus por campo visual y promedie los porcentajes resultantes para cada pozo de tratamiento para obtener la desviación estándar.
Para obtener imágenes de las células utilizando un microscopio de epifluorescencia o confocal, visualice la imagen en vivo de las células en la pantalla de la computadora según lo adquirido por la cámara. Ajuste el enfoque y la posición de las celdas utilizando el control del joystick y la rueda de enfoque. Establezca el porcentaje de potencia láser y el tiempo de exposición para los láseres de 512 nanómetros o 488 nanómetros y 568 nanómetros, de modo que la señal en la imagen se vea bien sin saturación.
Encienda la captura en vivo y examine la imagen resultante, asegurándose de que se vea un pico distinto para cada piso en los histogramas de visualización para ambos canales. Mientras visualiza la imagen en vivo de las células, tome múltiples imágenes representativas de un campo que contenga una o más celdas que expresen el reportero mCherry o dsRedmito para cada pozo de la placa. Los monocitos CD-14 positivos seleccionados incubados con GM-CSF durante siete días mostraron cambios en la morfología celular a lo largo del período de diferenciación, pasando de células de suspensión esférica a células de suspensión esférica a células delgadas y completamente unidas, y por último, a células más diseminadas cuando están completamente diferenciadas.
Las células totalmente diferenciadas fueron transectadas con los pares de caspasa BiFC VC y VN junto con el plásmido reportero dsRedmito, que se utilizó para etiquetar las células transectadas. Las células no tratadas no mostraron fluorescencia de Venus. Y en las células tratadas con nigericina, la caspasa-1 BiFC apareció como un solo punctum con la forma típica de las manchas de ASC.
La cuantificación de MDM positivo para Venus mostró que el mayor porcentaje de BiFC de caspasa-1 se observa en el grupo de tratamiento con LPS más nigericina. En la titulación de plásmidos de caspasa-1, 4 y 5 pares pro-BiFC, el mayor porcentaje de células venus-positivas resultó de 400, 500 y 1, 000 nanogramos de plásmido transectado, respectivamente. Las imágenes confocales obtenidas con un objetivo de 20 veces de un campo de células 24 horas después de la transección mostraron que las células transectadas no tratadas son viables ya que las mitocondrias están intactas.
Después del tratamiento con hemo, el complejo caspasa-1 aparece como un único punctum verde similar al inducido por la nigericina. Recuerde evitar condiciones duras y la manipulación excesiva de las células durante la diferenciación, la transfección y el tratamiento, ya que puede resultar en una activación espontánea y altos niveles de fondo de activación de la caspasa.
