Bu protokol önemlidir, çünkü belirli bir hastalık durumundaki canlı hücrelerde moleküler düzeyde inflamatuar kaspaz yolunu görselleştirmek ve sorgulamak için kullanılabilir. Bu tekniğin temel avantajı, primer immün hücrelerdeki inflamatuar kaspaz aktivasyon komplekslerinin bileşenlerini, gereksinimlerini ve lokalizasyonunu tanımlamak için kullanılabilmesidir. Küçük optimizasyonlarla, bu yöntem diğer birincil hücrelere ve oligomerizasyon ile aktive edilen bir dizi proteine uyarlanabilir ve uygulanabilirliği mikroskobik metodolojilerle sınırlı değildir.
İlk olarak, ortamı 10 santimetrelik bulaşıklarda tamamen farklılaşmış makrofajlardan aspire edin ve hücre tek katmanını ılık serum içermeyen RPMI-1640 ortamı ile yıkayarak tüm ortamları tamamen çıkarın. 10 santimetrelik çanak başına iki mililitre% 0.25 ılık tripsin-EDTA çözeltisi ekleyerek hücreleri hasat edin. Tripsin-EDTA'yı bir P-1000 mikropipet ile tüm çanak boyunca yukarı ve aşağı doğru yavaşça pipetleyin, ardından süspansiyonu beş mililitre sıcak tam kültür ortamı içeren 15 mililitrelik bir konik tüpe aktarın.
Parlak alan mikroskobu altında hücre ayrılmasını kontrol edin ve gerekirse tekrar ayırın. Ortamı aspire edin ve hücreleri 37 santigrat dereceye kadar önceden ısıtılmış 10 mililitre 1X steril PBS'de yeniden askıya alın. Daha sonra bir hemositometre kullanarak hücre sayısını belirlemek için 20 mikrolitrelik bir aliquot alın.
Transfeksiyon başına bir ila iki kez 10 ila beşinci hücre alın ve bunları 15 mililitrelik bir tüpe yerleştirin. Önceden ısıtılmış 1X steril PBS ile 15 mililitrelik son hacme getirin. PBS'yi aspire edin ve 250 x g'de bir dakika boyunca bir kez daha santrifüj yapın.
P-200 mikropipeti kullanarak hücre peletinden kalan PBS'yi çıkarın. Transfeksiyon başına 1,5 mililitrelik steril bir mikrotüp alın ve kaputa uygun muhabir plazmidini ve kaspaz BiFC plazmidlerini ekleyin. Pipet istasyonunu, cihazı, uçları, elektroporasyon tüplerini ve pipeti steril laminer akış başlığına yerleştirin.
Nükleofeksiyon cihazını bağlayın ve açın. Transeksiyon parametrelerini görüntülenen başlangıç ekranına girin. Voltaj üzerine basın, 1000 girin ve 1000 volta ayarlamak için Bitti düğmesine basın.
Genişlik üzerine basın, 40 girin ve darbeyi 40 milisaniyeye ayarlamak için Bitti düğmesine basın. Son olarak, elektrik darbelerinin sayısını 2 olarak ayarlamak için Darbeler üzerine basın, 2 girin ve Bitti düğmesine basın. Elektroporasyon tüplerinden birini alın ve oda sıcaklığında üç mililitre elektrolitik tampon E ile doldurun.
Elektroporasyon tüpünü pipet istasyonundaki pipet tutucuya yerleştirerek tüpün yan tarafındaki elektrotun içe baktığından ve tüp takıldığında bir tıklama sesi duyulduğundan emin olun. Hücre peletini alın ve beşinci hücrelere her biri için 10 ila iki kez 10 kez 10 mikrolitre önceden ısıtılmış resüsitasyon R tamponu ekleyin ve bir P-20 mikropipeti ile hafifçe karıştırın. Her transfeksiyon tüpüne 10 mikrolitre hücre süspansiyonu ekleyin ve bir P-20 mikropipeti ile hafifçe karıştırın.
Basmalı düğmeye ikinci durağa kadar basarak pipete bir uç yerleştirin ve kelepçenin uçtaki pistonun montaj sapını tamamen aldığından emin olun. Ardından, pipet üzerindeki basma düğmesine ilk durağa basın ve numuneyi aspire etmek için hücre veya plazmid DNA karışımı içeren ilk tüpe daldırın. Pipetin tıkırdadığından ve uygun şekilde yerleştirildiğinden emin olmak için pipeti numuneyle birlikte çok dikkatli bir şekilde pipet tutucuya yerleştirin.
Dokunmatik ekranda başlat düğmesine basın ve elektrik darbeleri teslim edilene kadar bekleyin. Pipetleri istasyondan yavaşça çıkarın ve hemen transekte edilmiş hücre süspansiyonunu, basma düğmesine ilk durağa yavaşça basarak önceden ısıtılmış antibiyotik içermeyen ortamla ilgili kuyuya ekleyin. Plakayı transekte hücrelerle hafifçe sallayın ve nemlendirilmiş bir doku kültürü inkübatöründe bir ila üç saat inkübe edin, ardından her bir kuyucuğa 200 mikrolitre önceden ısıtılmış kültür ortamı ekleyin.
Çanağı inkübatöre yerleştirin ve gen ekspresyonu için en az 24 saat bekleyin. Ertesi gün, bir epifloresan mikroskobu kullanarak hücre canlılığını ve transfeksiyon verimliliğini inceleyin. Ortamı bir P-1000 mikropipeti ile hücrelerden dikkatlice çıkarın ve kuyucuğun kenarına 500 mikrolitre uyaran çözeltisi ekleyin.
Tedavi edilmemiş kontrol kuyularını çalıştırmak için, uyaran olmadan bir görüntüleme ortamı ekleyin. Bir epifloresan veya konfokal mikroskop kullanarak hücreleri görselleştirmek için, talimatları izleyerek mikroskopu ve floresan ışık kaynağını açın. 10 kez veya 20 kez hedefi seçin ve kültür kabını mikroskop aşamasına yerleştirin.
Göz merceği ile 568 nanometre filtrenin altındaki hücreleri bulun. Ve muhabirin kırmızı hücrelerini ifade eden hücrelere odaklanın. Görme alanındaki tüm kırmızı hücreleri sayın.
Aynı görsel alandayken, 488 veya 512 filtrelerine geçin, aynı zamanda yeşil olan kırmızı hücrelerin sayısını sayın. En az üç alandan en az 100 kırmızı hücre sayın. Venüs-pozitif transekte hücrelerin görme alanı başına yüzdesini hesaplayın ve standart sapmayı elde etmek için her tedavi için ortaya çıkan yüzdelerin ortalamasını alın.
Bir epifloresan veya konfokal mikroskop kullanarak hücreleri görüntülemek için, bilgisayar ekranındaki hücrelerin canlı görüntüsünü kamera tarafından elde edildiği şekilde görselleştirin. Joystick kontrolünü ve odak tekerleğini kullanarak hücrelerin odağına ve konumuna ince ayar yapın. 512 nanometre veya 488 nanometre ve 568 nanometre lazerler için yüzde lazer gücünü ve pozlama süresini ayarlayın, böylece görüntüdeki sinyal doygunluk olmadan iyi görünür.
Canlı çekimi açın ve elde edilen görüntüyü inceleyerek her iki kanalın ekran histogramlarında her kat için ayrı bir tepe noktası görülmesini sağlayın. Hücrelerin canlı görüntüsünü görselleştirirken, plakanın her bir kuyucuğu için mCherry veya dsRedmito muhabirini ifade eden bir veya daha fazla hücre içeren bir alanın birden fazla temsili görüntüsünü alın. GM-CSF ile yedi gün boyunca inkübe edilen seçilmiş CD-14 pozitif monositler, farklılaşma periyodu boyunca hücre morfolojisinde, küresel süspansiyon hücrelerinden ve tam olarak bağlanmış ve son olarak, tamamen farklılaştığında daha fazla yayılmış hücrelere giden değişiklikler gösterdi.
Tamamen farklılaşmış hücreler, transekte hücreleri etiketlemek için kullanılan muhabir plazmid dsRedmito ile birlikte kaspaz BiFC çiftleri VC ve VN ile transekte edildi. Tedavi edilmeyen hücreler Venüs floresansı göstermedi. Ve nijeris ile tedavi edilen hücrelerde, kaspaz-1 BiFC, ASC lekelerinin tipik şekline sahip tek bir punctum olarak ortaya çıktı.
Venüs pozitif MDM'nin kantitasyonu, en yüksek kaspaz-1 BiFC yüzdesinin LPS artı nigerisin tedavi grubunda görüldüğünü göstermiştir. Kaspaz-1, 4 ve 5 pro-BiFC çiftlerinin plazmid titrasyonunda, Venüs pozitif hücrelerin en yüksek yüzdesi sırasıyla 400, 500 ve 1.000 nanogram transekte plazmidden kaynaklanmıştır. Transeksiyondan 24 saat sonra bir hücre alanının 20 katı bir hedefle elde edilen konfokal görüntüler, tedavi edilmemiş transekte hücrelerin mitokondri sağlam olduğu için canlı olduğunu göstermiştir.
Hem ile tedaviden sonra, kaspaz-1 kompleksi, nijerin tarafından indüklenene benzer tek bir yeşil punctum olarak ortaya çıkar. Farklılaşma, transfeksiyon ve tedavi sırasında sert koşullardan ve hücrelerin aşırı manipülasyonundan kaçınmayı unutmayın, çünkü spontan aktivasyona ve yüksek arka plan kaspaz aktivasyonu seviyelerine neden olabilir.
