Questo protocollo è significativo perché può essere utilizzato per visualizzare e interrogare la via della caspasi infiammatoria a livello molecolare nelle cellule viventi in un particolare stato patologico. Il vantaggio principale di questa tecnica è che può essere utilizzata per identificare i componenti, i requisiti e la localizzazione dei complessi infiammatori di attivazione della caspasi nelle cellule immunitarie primarie. Con ottimizzazioni minori, questo metodo può essere adattato ad altre cellule primarie e ad una gamma di proteine attivate dall'oligomerizzazione, e la sua applicabilità non è limitata alle metodologie microscopiche.
In primo luogo, aspirare il supporto da macrofagi completamente differenziati su piatti da 10 centimetri e lavare il monostrato cellulare con un mezzo RPMI-1640 caldo senza siero, rimuovendo completamente tutti i supporti. Raccogliere le cellule aggiungendo due millilitri di soluzione calda di tripsina-EDTA allo 0,25% per piatto di 10 centimetri. Pipettare delicatamente la tripsina-EDTA su e giù su tutta la piastra con una micropipetta P-1000, quindi trasferire la sospensione su un tubo conico da 15 millilitri contenente cinque millilitri di terreno di coltura completo caldo.
Controllare il distacco cellulare al microscopio a campo luminoso e staccarsi di nuovo se necessario. Aspirare il mezzo e risospesciare le cellule in 10 millilitri di PBS sterile 1X preriscaldato a 37 gradi Celsius. Quindi prendere un'aliquota di 20 microliti per determinare il numero di cellule usando un emocitometro.
Prendi una o due volte 10 alla quinta cellula per trasfezione e mettile in un tubo da 15 millilitri. Portare ad un volume finale di 15 millilitri con PBS sterile 1X preriscaldato. Aspirare il PBS e centrifugare ancora una volta per un minuto a 250 x g.
Rimuovere eventuali PBS residui dal pellet di cella utilizzando una micropipetta P-200. Prendi un microtubo sterile da 1,5 millilitri per trasfezione e aggiungi i plasmidi plasmidi plasmidi e caspasi BiFC appropriati nel cappuccio. Posizionare la stazione della pipetta, il dispositivo, le punte, i tubi elettroporati e la pipetta in una cappa a flusso laminare sterile.
Collegare e accendere il dispositivo di nucleofezione. Immettere i parametri di trasezione nella schermata di avvio visualizzata. Premere su Tensione, immettere 1000 e premere su Fatto per impostarlo su 1000 volt.
Premere su Larghezza, immettere 40 e premere fine per impostare l'impulso su 40 millisecondi. Infine, premere su Impulsi, immettere 2 e premere su Fine per impostare il numero di impulsi elettrici su 2. Prendere uno dei tubi di elettroporazione e riempirlo con tre millilitri di tampone elettrolitico E a temperatura ambiente.
Inserire il tubo di elettroporazione nel supporto della pipetta sulla stazione della pipetta, assicurandosi che l'elettrodo sul lato del tubo sia rivolto verso l'interno e che si senta un suono di clic quando il tubo viene inserito. Prendere il pellet cellulare e aggiungere 10 microlitri di tampone R di risospensione preriscaldato per ciascuno da uno a due volte 10 alla quinta cella e mescolare delicatamente con una micropipetta P-20. Aggiungere 10 microlitri della sospensione cellulare a ciascun tubo di trasfezione e mescolare delicatamente con una micropipetta P-20.
Inserire una punta nella pipetta premendo il pulsante al secondo stop, assicurandosi che il morsetto raccolga completamente lo stelo di montaggio del pistone nella punta. Quindi, premere il pulsante sulla pipetta fino alla prima fermata e immergersi nel primo tubo contenente la miscela di DNA cellulare o plasmidico per aspirare il campione. Inserire la pipetta con il campione con molta attenzione nel supporto della pipetta, assicurandosi che la pipetta scatti e sia posizionata in modo appropriato.
Premere start sul touch screen e attendere fino a quando gli impulsi elettrici non vengono erogati. Rimuovere lentamente la pipetta dalla stazione e aggiungere immediatamente la sospensione cellulare transettata nel pozzetto corrispondente con il mezzo preriscaldato privo di antibiotici premendo lentamente il pulsante alla prima fermata. Scuotere delicatamente la piastra con cellule transettate e incubare per una o tre ore in un incubatore di colture tissutali umidificate, quindi aggiungere 200 microlitri di terreno di coltura preriscaldato a ciascun pozzetto.
Posizionare il piatto nell'incubatrice e attendere almeno 24 ore per l'espressione genica. Il giorno successivo, ispezionare la vitalità cellulare e l'efficienza di trasfezione utilizzando un microscopio a epifluorescenza. Rimuovere accuratamente il fluido dalle cellule con una micropipetta P-1000 e aggiungere 500 microlitri della soluzione di stimolo lungo il lato del pozzo.
Per eseguire pozzetti di controllo non trattati, aggiungere un mezzo di imaging senza lo stimolo. Per visualizzare le cellule utilizzando un microscopio a epifluorescenza o confocale, accendere il microscopio e la sorgente luminosa fluorescente seguendo le istruzioni. Selezionare l'obiettivo 10 volte o 20 volte e posizionare il piatto di coltura sul palco del microscopio.
Trova le cellule sotto il filtro a 568 nanometri con l'oculare. E concentrati sulle cellule che esprimono i globuli rossi del reporter. Conta tutti i globuli rossi nel campo visivo.
Mentre nello stesso campo visivo, passa ai filtri 488 o 512, conta il numero di globuli rossi che sono anche verdi. Contare almeno 100 globuli rossi di almeno tre campi. Calcola la percentuale di cellule transettate positive a Venere per campo visivo e calcola bene le percentuali risultanti per ciascun trattamento per ottenere la deviazione standard.
Per visualizzare le cellule utilizzando un microscopio a epifluorescenza o confocale, visualizzare l'immagine dal vivo delle cellule sullo schermo del computer acquisita dalla fotocamera. Ottimizza la messa a fuoco e la posizione delle celle utilizzando il controllo del joystick e la rotellina di messa a fuoco. Impostare la percentuale di potenza laser e il tempo di esposizione per i laser a 512 nanometri o 488 nanometri e 568 nanometri, in modo che il segnale nell'immagine abbia un bell'aspetto senza saturazione.
Attiva l'acquisizione dal vivo ed esamina l'immagine risultante, assicurandoti che venga visualizzato un picco distinto per ogni piano negli istogrammi di visualizzazione per entrambi i canali. Mentre visualizzi l'immagine dal vivo delle celle, scatta più immagini rappresentative di un campo che contiene una o più celle che esprimono il reporter mCherry o dsRedmito per ogni pozzetto della piastra. I monociti CD-14 positivi selezionati incubati con GM-CSF per sette giorni hanno mostrato cambiamenti nella morfologia cellulare nel corso del periodo di differenziazione, passando da cellule in sospensione sferica a cellule spinose e completamente attaccate e, infine, a cellule più diffuse quando completamente differenziate.
Le cellule completamente differenziate sono state transettate con le coppie di caspasi BiFC VC e VN insieme al plasmide reporter dsRedmito, che è stato utilizzato per etichettare le cellule transettate. Le cellule non trattate non hanno mostrato fluorescenza di Venere. E nelle cellule trattate con nigericina, la caspasi-1 BiFC è apparsa come un singolo punctum con la tipica forma di granelli ASC.
La quantificazione di MDM Venus-positive ha mostrato che la più alta percentuale di caspasi-1 BiFC è osservata nel gruppo di trattamento LPS più nigericina. Sulla titolazione plasmidica di coppie caspasi-1, 4 e 5 pro-BiFC, la più alta percentuale di cellule Venus-positive è risultata da 400, 500 e 1.000 nanogrammi di plasmide transetto, rispettivamente. Le immagini confocali ottenute con un obiettivo 20 volte superiore di un campo di cellule 24 ore dopo la transezione hanno mostrato che le cellule transettate non trattate sono vitali poiché i mitocondri sono intatti.
Dopo il trattamento con eme, il complesso caspasi-1 appare come un singolo punctum verde simile a quello indotto dalla nigericina. Ricorda di evitare condizioni difficili e un'eccessiva manipolazione delle cellule durante la differenziazione, la trasfezione e il trattamento in quanto può comportare un'attivazione spontanea e alti livelli di attivazione della caspasi.
