الأطراف المؤتلفة هي نموذج قوي لدراسة في عملية تمايز الخلايا وتشكيل الطاقة تحت تأثير الإشارات الجنينية في بيئة الجسم الحي. يسمح هذا الفحص باختلافات متعددة تسمح بالتطبيقات المحتملة دون أن تقتصر على بيولوجيا نمو أطراف الدجاج. يمكن تطبيقه على جذع أو سلف آخر من الكائنات الحية الأخرى.
للبدء ، قم بإزالة البيض من الحاضنة بعد ثلاثة أيام ونصف ، ومسحة مع 70 ٪ من الإيثانول ، وتركها لتجف في الهواء. بعد ذلك ، حدد الأجنة النامية وحددها عن طريق تشميع البويضة ومراقبة الأوعية الدموية. تخلص من البيض الذي ليس لديه جنين.
اضغط على الطرف الحاد من قشرة البيضة بنهاية زوج من الملقط الحاد لفتح نافذة وإزالة حوالي سنتيمتر مربع واحد من القشرة باستخدام الملقط. ثم انقل البيض إلى حامل بلاستيكي أو كرتوني. ضع البيض واحدا تلو الآخر تحت المجهر المجسم.
حدد غشاء الهواء وقم بإزالته عن طريق التقاط ثقب صغير في المنطقة دون أي أوعية. اسحب هذه المنطقة للخارج بمساعدة ملقط جراحي دقيق وأزل قطعا من قشر البيض الملامسة للجنين. المسيل للدموع فتح الكيس الأمنيوسي مع ملقط جراحي دقيق.
قم بإزالة الجنين بعناية من البويضة باستخدام ملقط حاد وانقله إلى طبق بتري معقم يحتوي على 1x PBS بارد مثلج. اغسل الأجنة مرة واحدة في الجليد البارد 1x PBS واسحب أي أغشية متبقية تحت المجهر المجسم. ثم حدد موقع براعم الأطراف الخلفية.
قص كل برعم خلفي طوليا ، وقطع قريبة جدا من جناح الجنين مع ملقط جراحي دقيق. الحفاظ على الأجنة في 1x PBS. ثم انقل براعم الأطراف إلى أنبوب طرد مركزي صغير سعة 1.5 ملليلتر باستخدام ماصة نقل بلاستيكية.
بعد ذلك ، استبدل PBS ب 500 ميكرولتر من محلول التربسين بنسبة 0.5٪. احتضان براعم الأطراف في كتلة حرارية لمدة سبع دقائق عند 37 درجة مئوية. ثم استبدل محلول التربسين ب 500 ميكرولتر من ملليغرام لكل ملليلتر كولاجيناز من النوع الرابع في HBSS واحتضنه في الكتلة الحرارية لمدة ثماني دقائق أخرى.
قم بإزالة أكبر قدر ممكن من الكولاجيناز واستبدله بملليلتر واحد من DMEM البارد عالي الجلوكوز مع 10٪ FBS لتعطيل الإنزيمات. ماصة الخليط بلطف حوالي 10 مرات. قم بتصفية التعليق الذي يحتوي على الخلايا باستخدام مصفاة خلية 70 ميكرومتر لترك الأديم الخارجي وراءه.
ماصة التعليق مرة أخرى حوالي خمس إلى 10 مرات وأجهزة الطرد المركزي في 200 مرة غرام لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. ثم تخلص من السوبرناتانت. اغسل الكولاجيناز الزائد بملليلتر واحد من الوسائط ، ثم قم بالطرد المركزي للتعليق وتخلص من الوسط بعناية.
بعد ذلك ، أضف 1.5 ملليلتر من الوسائط دون إزعاج الخلايا واحتضنها لمدة ساعة إلى 1.5 ساعة عند 37 درجة مئوية في كتلة حرارية ، مما يسمح للخلايا بتكوين حبيبة مدمجة. بعد الحصول على براعم الأطراف الخلفية ، قم بنقلها إلى أنبوب طرد مركزي صغير فارغ باستخدام ماصة بلاستيكية. قم بإزالة أي فائض 1x PBS واستبدله ب 500 ميكرولتر من 0.5٪ من التربسين في 1x PBS معقم.
احتضن الخليط لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية في كتلة حرارية. انقل محلول التربسين مع براعم الأطراف إلى طبق بتري معقم. ثم قم بإزالة أكبر قدر ممكن من التربسين الزائد وإغراق طبق بتري مع 1x PBS البارد مع 10٪ FBS حتى يتم تغطية جميع براعم الأطراف.
تحديد براعم الأطراف تحت المجهر المجسم. بعد ذلك ، حدد الأديم الخارجي كغشاء شفاف منفصل قليلا عن خلايا الجلد المتوسط للأطراف. افصل الأديم الخارجي وافصله باستخدام ملقط يحمل الطرف الأقرب من برعم الطرف باستخدام ملقط جراحي دقيق.
خذ حبيبة الجلد المتوسط من الخطوات السابقة وتخلص من حوالي 600 ميكرولتر من الوسط. ثم افصل الكريات بعناية بطرف ماصة دون تحطيمها. اقلب الأنبوب رأسا على عقب لنقل الكريات إلى طبق بتري الذي يحتوي على الأديم الخارجي الفارغ.
قطع قطعة صغيرة من الكريات مع زوج من الملقط الجراحي الدقيق ووضعها في أقرب مكان ممكن إلى الأديم الخارجي. افتح الأديم الخارجي باستخدام الملقط الجراحي وضع الكرية بإحكام قدر الإمكان في قاعة الجلد الخارجي. افتح الكيس الأمنيوسي بالقرب من الطرف الأمامي لكشف الجناح الأيمن للجنين.
مسترشدا بوضع الطرف الأمامي ، قم بإجراء خدش الجرح بإبرة التنغستن بطول اثنين إلى ثلاثة سوميت ، مما يؤدي إلى إتلاف الأديم المتوسط قليلا حتى ينزف. نقل الأطراف المؤتلفة بشكل فردي إلى جنين الفرخ ، ووضع قاعدته فوق جرح سوميت. إصلاح الطرف المؤتلف بشكل صحيح مع قطعتين من أسلاك البلاديوم.
محاذاة قاعدة الطرف المؤتلف مع الجرح. أغلق النافذة بشريط لاصق وأعد البيضة إلى الحاضنة. في عملية الزرع الناجحة ، لوحظ أن الطرف المؤتلف هو نتوء تم ربطه بشكل آمن بجدار الجلد المتوسط للجنين المتبرع.
على العكس من ذلك ، تم فصل الطرف المؤتلف عن جدار الجلد المتوسط أو قدم مورفولوجيا خشنة عندما فشلت صلاحية الخلية أو الكسب غير المشروع. أظهر تلطيخ ألسيان الأزرق عناصر الهيكل العظمي في طرف مؤتلف من الدجاج والدجاج لمدة ستة أيام. قبل مسح الأزرق السياني ، تم الحصول على صور في الإيثانول للقياسات المورفولوجية والكمية.
تم تقطيع الأطراف الملطخة أو غير الملطخة H&E لمراقبة الأنسجة والخلايا. يمكن لهذه التقنية تطوير عضويات الأطراف في الجسم الحي ودراسة تمايز الخلايا أو العملية المورفوجينية باستخدام الخلايا الجذعية من مصادر أو أنواع مختلفة.
